《New Biotechnology》：Adaptive laboratory evolution of Actinobacillus succinogenes for enhanced acid tolerance and succinic acid production
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本研究针对琥珀酸（SA）发酵需中性pH导致下游成本高的问题，通过三阶段连续培养ALE策略，将 Actinobacillus succinogenes 130Z 的耐受pH从6.3降至5.4，获得进化菌株BAT1。其在pH 5.6下SA产量达12.8 g/L，较野生型（4.9 g/L）提升约2.6倍，为低pH生物制造提供了关键底盘菌株。
琥珀酸（Succinic acid, SA）是一种重要的C4平台化学品，广泛应用于食品、化工及制药领域。传统石化路线面临环境压力，而微生物发酵法虽可持续，但常用菌株多为中性菌，需在pH 6.5–7.0下发酵，导致产物以盐形式存在，后续需复杂的酸化提纯步骤，推高了成本。若能在低pH（如5.0–6.0）下发酵，不仅可省去中和剂，还能与纤维素酶解（最适pH 5.0–6.0）耦合，实现同步糖化发酵（SSF），大幅提升经济性。
Actinobacillus succinogenes（产琥珀酸放线杆菌）是天然的高产SA菌株，能利用多种糖类，但其在低pH下生长严重受限，限制了工艺优化。虽然基因组改组和定向进化已有尝试，但稳定、高效的耐酸菌株构建及机制解析仍不充分。为此，Park等人在《New Biotechnology》发表研究，通过适应性实验室进化（ALE）结合连续发酵策略，成功选育出耐酸突变株，并揭示了其背后的基因突变谱。
关键技术方法
研究采用三阶段连续发酵ALE策略（总计约3268 h），逐步将pH从6.3降至5.4，并优化CO2供给（2 bar, 0.1 vvm）及NaCl浓度（0.1 M）以维持碳源与离子强度。通过HPLC监测代谢产物，结合全基因组测序鉴定关键突变，最终在5-L反应器（pH 5.6）中验证了进化菌株BAT1的发酵性能。
结果与讨论
1. ALE进化轨迹与酸耐受性提升
通过三阶段连续培养（Phase 1: pH 6.2–5.9; Phase 2: pH 6.1–5.5; Phase 3: pH 5.6–5.4），研究团队逐步降低了培养基的化学缓冲能力（减少碳酸盐，增加CO2物理供给），迫使菌群适应质子压力。野生型菌株在pH 6.3时生长已显著抑制，而进化后的群体在pH 5.4仍能维持稳定生长。从进化终点分离的菌株在pH 5.6下表现出显著升高的生物量（OD600）和延长的稳定期，表明ALE成功赋予了其在工业相关低pH条件下的生存优势。
2. 进化菌株BAT1的低pH发酵性能
在5-L批次发酵中，进化菌株BAT1在pH 5.6、48 h内产SA达12.8 g/L，是对照野生型（4.9 g/L）的约2.6倍，且葡萄糖消耗速率和细胞干重均显著提升。值得注意的是，在更严苛的pH 5.4条件下，BAT1仍能维持约10 g/L的产量，而野生型几乎停滞。这一性能验证了ALE不仅提高了菌株的生存能力，还同步增强了其低pH下的代谢通量，特别是还原性TCA循环（rTCA）的活性。
3. 基因突变揭示耐酸机制
全基因组测序发现，BAT1在多个功能基因上积累了关键突变：
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转运系统：BCCT家族（甜菜碱/肉碱转运蛋白）和NupC/NupG（核苷转运蛋白）发生错义突变，可能通过调节溶质摄取维持胞内渗透压及pH稳态。
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细胞膜与壁：LrgB（调控细胞自溶）和酰基转移酶基因突变，可能通过改变膜脂组成和肽聚糖水解来增强膜完整性，防止酸诱导的膜泄漏。
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代谢调控：DksA（转录调控子）和NAD+激酶突变，可能重塑了碳流分配，优先支持SA合成而非副产物（如乙酸、乙醇）。
这些突变共同构建了一个多基因防御网络，使菌株在酸性环境中维持了更高的胞内ATP和还原力水平。
结论与意义
该研究通过ALE策略，成功将A. succinogenes的工业操作窗口从近中性拓展至pH 5.4–5.6，大幅降低了发酵过程的中和剂用量与下游分离成本。BAT1菌株的高产表现证明了“耐酸性”与“高产性”可协同进化。更重要的是，鉴定的突变基因（如BCCT、LrgB）为后续利用合成生物学手段直接改造工业菌株提供了精准靶点，加速了生物基琥珀酸的低成本制造进程。
