《New Biotechnology》：A comparative analysis of signal peptide signatures in the bacterial cell factories Bacillus subtilis and Lactococcus lactis
编辑推荐：
本研究为优化革兰氏阳性菌细胞工厂（枯草芽孢杆菌与乳酸乳球菌）的分泌型重组蛋白生产，开展了全面的信号肽（SP）特征比较分析。研究人员通过生物信息学方法，系统比较了两种细菌中引导蛋白质分泌、定位的信号肽在长度、电荷、切割位点及成熟蛋白性质等方面的差异，并分析了实际应用中信号肽的选择偏好。该研究揭示了物种特异性信号肽特征，为理性设计高效分泌信号、提升重组蛋白产量提供了关键线索和理论依据。
在工业、医疗和可持续生物经济中，分泌型重组蛋白扮演着至关重要的角色。然而，如何让目标蛋白高效地“走出”细胞，进入发酵液以便于纯化，是一个核心挑战。革兰氏阳性单层膜细菌，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），因其相对简单的细胞包膜结构和高效的蛋白质分泌机制，成为极具吸引力的细胞工厂。但仅有高效的分泌机器还不够，精准的“导航信号”——信号肽（Signal Peptide, SP）同样关键，它负责将蛋白质从细胞质引导穿过细胞质膜和细胞壁。有趣的是，不同蛋白质甚至不同物种的信号肽长度和序列千差万别，这为优化特定目标蛋白的分泌效率带来了巨大变数和机遇。目前，针对这两种常用细胞工厂的信号肽特征缺乏系统的比较，在实际重组蛋白生产中使用的信号肽是否最优也存有疑问。为此，发表在《New Biotechnology》上的这项研究，对枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌中的信号肽进行了一次全面的“普查”和对比，旨在为设计更高效的分泌信号提供蓝图。
研究人员主要运用了生物信息学分析流程。他们选取了常用的模式菌株枯草芽孢杆菌168和乳酸乳球菌NZ9000的蛋白质组数据。首先，使用SignalP 6.0预测信号肽的存在、类型（如Sec依赖型SPI、脂蛋白型SPII、Tat途径型）及切割位点。接着，利用DeepTMHMM预测蛋白质的跨膜螺旋，以区分膜蛋白和分泌蛋白。然后，结合CDD-batch和Interpro在线工具，分析蛋白质是否含有细胞壁结合结构域（如LPxTG、LysM、SH3b等），从而进一步精确预测蛋白质的亚细胞定位（如分泌到胞外、共价/非共价结合于细胞壁、脂锚定于膜上等）。最后，使用ExPASy的Compute pI/Mw工具计算信号肽和成熟蛋白的等电点（pI）与分子量。
蛋白质定位预测与分布比较
通过上述分析流程，研究人员系统评估了两种细菌中所有预测为分泌蛋白的定位情况。结果显示，相对于各自的总蛋白质组，枯草芽孢杆菌中预测为分泌途径的蛋白质比例（6.70%）高于乳酸乳球菌（4.29%）。然而，两者中最终被预测为真正分泌到胞外的蛋白质比例却很接近（分别为44.6%和45.0%）。一个明显的差异是，乳酸乳球菌中细胞壁结合蛋白的比例（18.51%）显著高于枯草芽孢杆菌（6.37%）。
信号肽长度与区域特征分析
研究发现，两种细菌信号肽的平均长度略有差异：枯草芽孢杆菌为24.5个氨基酸，乳酸乳球菌为26.3个氨基酸。一个突出的现象是，共价结合于细胞壁的蛋白质其信号肽长度远超平均值，在枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌中平均分别达到42和36.6个氨基酸。这可能与需要将C端的LPxTG基序 optimally呈现给膜结合的转肽酶（Sortase）有关。相比之下，脂蛋白的信号肽通常较短（枯草芽孢杆菌19.95，乳酸乳球菌21.2），这可能与其含有很短的C区（即脂盒，lipobox）以及被特异的II型信号肽酶（Lsp）切割有关。进一步将信号肽按N区（带正电）、H区（疏水）和C区（含切割位点）划分后发现，细胞壁结合蛋白信号肽的N区普遍长于分泌蛋白和脂蛋白的N区。
信号肽电荷与切割位点偏好
分析信号肽中带正电氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）的数量发现，乳酸乳球菌分泌蛋白信号肽中的平均正电荷数略高于枯草芽孢杆菌。当将电荷数与信号肽长度关联分析时，两种细菌分泌蛋白信号肽的电荷密度相似。但枯草芽孢杆菌共价细胞壁结合蛋白信号肽的正电荷密度高于乳酸乳球菌。在信号肽酶切割位点分析中，枯草芽孢杆菌的分泌蛋白和细胞壁结合蛋白强烈偏好Ala-x-Ala共识基序（-3至-1位），且在切割后+1位偏好丙氨酸（Ala），+2位偏好带负电的谷氨酸（Glu）。而乳酸乳球菌在-3位可以是Val或Ala，在+1位偏好天冬氨酸（Asp），+2位偏好苏氨酸（Thr）。对于脂蛋白，两者差异较小，但枯草芽孢杆菌在-1位略有甘氨酸（Gly）偏好。
成熟蛋白的物理化学性质
研究还计算了成熟蛋白的等电点（pI）。发现枯草芽孢杆菌细胞壁结合蛋白的平均pI（8.15）显著高于乳酸乳球菌的同类蛋白（5.17）。这表明，在枯草芽孢杆菌中，较高的pI可能促进蛋白质与带负电的细胞壁聚合物（如磷壁酸）的相互作用，从而影响其定位或滞留。这提示目标蛋白的pI是其在异源表达时需要考虑的一个潜在分选信号。
实际应用信号肽与天然信号肽的对比
研究人员还将分析结果与实际重组蛋白生产中常用的信号肽进行了对比。在乳酸乳球菌中，最常用的信号肽来自其主要分泌蛋白Usp45，其长度为27个氨基酸，与天然分泌蛋白信号肽平均长度（28.9）接近。但在枯草芽孢杆菌中，一个有趣的现象是，实际应用中优选信号肽的平均长度（31.5个氨基酸）明显长于其天然分泌蛋白信号肽的平均长度（28.1个氨基酸）以及所有分泌途径蛋白信号肽的平均长度（24.5个氨基酸）。这表明在实际生产中有使用更长信号肽的倾向，但其是否是最优选择值得进一步探究。
结论与讨论
本研究首次对枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌这两种重要革兰氏阳性细胞工厂的分泌蛋白质组进行了全面的信号肽特征比较和编目。研究得出了若干重要结论：首先，两种细菌在分泌蛋白的比例、细胞壁结合蛋白的丰度上存在物种差异。其次，不同定位目标（分泌、细胞壁结合、脂锚定）的蛋白质，其信号肽在长度、电荷分布、切割位点基序上具有不同的特征规律，例如细胞壁共价结合蛋白的信号肽异常长。再者，成熟蛋白的等电点，尤其是细胞壁结合蛋白的pI，在两种细菌间差异显著，可能影响其与细胞壁的静电相互作用。最后，对比实际应用信号肽发现，枯草芽孢杆菌中倾向于使用比天然信号肽更长的信号肽进行重组蛋白生产。
这些发现具有重要的理论和实践意义。它们不仅增进了我们对细菌蛋白质分泌和分选基础生物学的理解，更重要的是为理性优化重组蛋白生产提供了直接线索。研究指出，未来开发高效分泌系统的关键方向包括：评估当前所用信号肽是否最优；探索能否开发出普适性高效信号肽，或必须为特定目标蛋白“量身定制”；以及能否设计出更短小但同样高效的信号肽。通过大规模信号肽筛选建立预测模型，或基于本研究揭示的信号肽多样性进行理性设计，将有望显著提升枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌作为细胞工厂生产有价值重组蛋白的效率和产量。
