《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Marine Bacterial Polyhydroxyalkanoates Suppress Xanthomonas Virulence in Cowpea: In Vitro, In Vivo, and In Silico Evidence
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Cowpea faces bacterial blight from Xanthomonas sp., and PHA from marine bacteria shows potential as eco-friendly biocontrol.摘要
Ganesan Vinitha | Yamuna Annadurai | A. Robert Antony
中央生物医学研究实验室，Vinayaka Mission医学院和医院，Vinayaka Missions研究基金会（DU），印度本地治里卡拉卡尔
摘要
豇豆（Vigna unguiculata）是许多亚洲国家重要的蛋白质来源和主要的食物豆类。特别是在印度，它既是农村地区也是城市地区的主要蛋白质来源。豇豆受到由Xanthomonas属细菌引起的细菌性枯萎病的影响，这种病原体以其对多种重金属和抗生素的抵抗力而闻名。该病原体不仅影响植物，还显著增加了人类病原体（如Salmonella属细菌）的传播，这加剧了食品安全问题。在这项研究中，从海洋海藻中分离出了两种具有高生物聚合物产量的共生细菌菌株：Alcaligenes属和Pseudomonas属。这些生物聚合物（如聚羟基烷酸酯（PHA）在试点规模上进行了生产，并通过FT-IR分析进行了表征。还通过体外实验评估了它们对Xanthomonas属细菌的抗菌效果，并在豇豆植株上进行了体内试验验证。研究结果表明，这些生物聚合物显著降低了V. unguiculata的细菌致病性。这表明这些生物聚合物在管理细菌性枯萎病方面具有很好的潜力。此外，研究还利用了分子对接和动力学分析方法，预测PHA可能是一种潜在的黄原胶抑制剂和抗菌化合物。本研究强调了海洋细菌生物聚合物在有效控制植物病害、提高食品安全以及通过减少食物链中的病原体传播来改善人类健康方面的潜力。
引言
豇豆（Vigna unguiculata）是亚洲重要的食物豆类，因其高蛋白质含量以及丰富的膳食纤维和促进健康的生物活性化合物而广泛种植[1]。豇豆也被称为“穷人的肉”，在印度等发展中国家非常受欢迎，因为其种子、豆荚和叶子中的蛋白质含量分别高达（23–29%）、（18–25%）和（23–40%）[2]、[3]。随着全球对可持续和适应气候变化的粮食作物需求的增加，豇豆在支持营养和加强粮食系统方面的作用重新受到了关注[4]。
尽管豇豆具有营养和经济价值，但其生产仍面临来自病原菌（如Xanthomonas属）的严重生物压力，这是影响作物产量和质量的最常见原因之一。传统的依赖化学农药的管理方法引发了关于环境可持续性、人类健康风险以及抗生素耐药性病原体出现的担忧[5]。这凸显了开发环保、基于生物控制的策略以实现更高产量和可持续生产的紧迫性[6]、[7]。在新兴方法中，微生物生物聚合物因其控制植物病原体的潜力而受到关注。聚羟基烷酸酯（PHA）是一种由细菌和古菌合成的天然生物聚合物。在胁迫条件下，微生物可以产生这些生物聚合物以适应极端环境（如营养受限的环境）[8]。PHA被定义为3-、4-、5-和6-羟基酸的线性聚酯，形成直径通常在0.2到0.8微米之间的细胞内颗粒。PHA易于降解，产生二氧化碳和水，因此对环境安全[7]。结合其生物相容性和化学多样性，PHA成为合成聚合物的环境可持续替代品。微生物衍生的生物聚合物也因其潜在的抗菌活性而受到关注，包括对抗Xanthomonas属细菌的能力。
植物病原体Xanthomonas是豇豆细菌性枯萎病的主要原因。鉴于基于农药的管理方法的局限性以及化学残留物带来的风险，人们越来越关注寻找更安全的试剂来抑制病原体的毒力并限制疾病的传播。与海藻相关的PHA产生细菌提供了一个有前景的选择，因为它们适应了营养变化大的海洋环境，并能高效且可持续地生产生物聚合物。此外，这些海洋细菌产生的PHA对食物链的风险很小，因为它们具有已建立的生物相容性和食品接触应用的监管批准。作为细胞内生物聚合物，PHA无毒且可生物降解为无害的代谢物（如3-羟基丁酸），并已根据EU 10/2011和FDA 21 CFR等标准获得安全认证，适用于直接接触食品的包装材料。现有研究表明，在田间条件下，残留化合物不会迁移到作物或可食用组织中，任何来自生物控制应用的PHA残留物都会迅速降解，不会在人体内积累或转移[10]。
Xanthomonas的毒力通过产生胞外多糖（EPS）来调节，这是一种称为黄原胶的胶状物质。这种物质负责细菌的附着、定殖、生物膜形成以及抑制植物的防御机制[11]、[12]。针对EPS生物合成的研究被认为是一种减轻细菌毒力的有效方法[11]。黄原胶的合成受wxc基因簇的调控，WxcM基因编码黄原胶组装中的糖基转移酶催化（重复糖单位的形成）[13]。Wxc基因的突变会消除EPS的产生并降低毒力。WxcM基因的突变会降低病原性[14]。尽管WxcM的生物学意义重要，但其与潜在激动剂化合物的分子水平相互作用仍研究有限。因此，PHA作为可生物降解和具有抗菌活性的产品具有潜力；然而，PHA与植物病原体毒力相关酶的相互作用尚未详细研究。探索这些相互作用可能会提供新的抗毒力方法，这些方法针对的是细菌的适应性而非生存能力，从而减少抗性发展的选择压力。本研究采用了一种结合分子对接和长时间尺度分子动力学（MD）模拟的集成计算机模拟方法，来研究PHA与WxcM的结合机制和稳定性。分子对接用于确定优选的结合模式和关键相互作用残基，而MD模拟则用于评估WxcM–PHA复合物在生理条件下的动态行为、结构稳定性和构象灵活性。
基于这些需求，本研究旨在优化从海藻相关细菌分离株中生产PHA，并评估提取的聚合物对Xanthomonas属细菌的抗菌活性，后者是豇豆枯萎病的致病因子。通过结合聚合物生产、表征、体外实验、苗圃试验以及分子对接和动力学分析，本工作展示了微生物衍生、可生物降解的聚合物作为植物安全且有效的疾病管理工具的潜力。
PHA生产菌株的分离
从印度泰米尔纳德邦Tuticorin地区的Manapad海岸收集了Kappaphycus alerversii和Eucheuma denticulatum海藻。用无菌蒸馏水多次清洗海藻，以去除松散附着的碎屑和沉积物。未进行剧烈的表面灭菌处理，研究的主要目的是自然分离与海藻表面相关的可培养细菌。清洗后的海藻用无菌剪刀切成小块。
PHA生产细菌的分离
从海洋环境中分离出了大量潜在的微生物，特别是适合生产生物聚合物的细菌。主要目标是分离来自海藻相关细菌的各种PHA生产菌株，以生产不同类别的PHA。本研究使用了两种海藻Eucheuma denticulatum和Kappaphycus alvarezii，如图1a和1b所示。从海藻中获得的细菌菌落在VNSS上培养。
讨论
PHA被认为是多种应用的理想替代品，如生物农药和除草剂。由于它是从微生物中提取的生物产品，因此更具成本效益且由于可生物降解性而更加环保。本研究专注于优化从海藻相关细菌菌株中生产PHA，以降低生产成本同时确保产品效果和纯度。根据现有研究，许多细菌能够
限制和未来方向
该聚合物是通过微生物生物质生物合成的，因此在这种系统中存在少量残留水分或微量细胞成分是常见的，即使经过标准提取和干燥程序也可能存在。这在FT-IR结果中表现为较弱的吸收峰，这些峰被解释为来自残留杂质的信号，而不是PHA的固有结构特征。
重要的是，观察到的主要酯类和脂肪族官能团的吸收
结论
从海洋海藻中分离出了两种能够高效积累PHA的微生物群体。本研究旨在解决当前研究中的两个关键问题：对海藻相关细菌作为低成本PHA生产者的探索不足，以及缺乏使用微生物衍生PHA作为对抗主要植物病原体（如Xanthomonas属）的抗菌剂的证据。确认了A3和S3两种分离株在营养受限条件下都能有效生产PHA。
AI披露
作者使用OpenAI来改进手稿的语言和语法。Write for me被用于准备图形摘要。作者声明他们对研究结果和解释负全责。
CRediT作者贡献声明
Robert Antony A：写作——审稿与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、概念化。Vinitha Ganesan：写作——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法学、研究、数据管理、概念化。Yamuna Annadurai：初稿撰写、软件使用、资源管理、方法学、研究、数据管理
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢美国乔治亚州亚特兰大Emory医学院分子生物学、生物化学与免疫学系的Murugesh Easwaran博士提供Schr?dinger软件和计算设施的使用权。作者感谢使用Schr?dinger Suite (Maestro 2023-4)进行分子对接和分子动力学模拟。
