《Nature Communications》：Small RNA genomics of Aedes aegypti mosquitoes discovers infectious viruses that trigger an RNA interference response
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为应对传统病毒监测方法在发现新型昆虫病毒及评估其持久感染能力方面的局限，研究者对全球200多份埃及伊蚊样本进行了病毒小RNA（vsmRNA）组学分析。该研究不仅鉴定出多种活跃感染伊蚊的病毒，揭示了其地理分布界限，还首次在野生样本中检测到登革热病毒vsmRNA，并通过实验证实这些病毒可稳定感染蚊细胞并触发具有基因沉默功能的RNAi应答。此vsmRNA组学方法为现有媒介监测体系增添了有力工具，有助于发现蚊群中持续存在的新病毒。
在全球公共卫生领域，埃及伊蚊（Aedes aegypti）是登革热、寨卡等多种虫媒病毒病的主要传播媒介，对人类健康构成持续威胁。传统的病毒监测手段，如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），通常只能检测已知病毒，且难以区分病毒载量的高低，更无法有效揭示病毒在蚊群中的持久感染状态及其与宿主免疫系统的互动。特别是，昆虫病毒如何在蚊群中持续存在、它们如何与蚊子的RNA干扰（RNAi）等免疫应答相互作用、以及垂直传播的频率如何，这些问题在很大程度上仍是未解之谜。这限制了我们全面评估蚊媒病毒库及其潜在流行病学风险的能力。为了突破这些局限，一项发表在《Nature Communications》上的研究另辟蹊径，利用病毒小RNA（vsmRNA）组学这一独特视角，对全球范围内的埃及伊蚊进行了一次深入的“病毒普查”。
研究人员为了系统探究哪些病毒能感染埃及伊蚊并激发其小RNA免疫应答，开展了一项大规模的组学研究。他们收集并分析了来自美洲、亚洲、非洲的超过200份埃及伊蚊样本（包括野外采集和实验室品系）的小RNA测序数据，并整合了已公开的数据集，总计超过280个小RNA和长RNA测序库。研究团队开发并优化了名为“蚊虫小RNA组学”（MSRG）的分析流程，并辅以VirusDetect程序，利用最新的病毒数据库进行全面的病毒发现。为了验证通过测序发现的病毒确实具有感染性，他们用蚊组织匀浆滤液感染了C6/36和Aag2等蚊细胞系，建立了稳定感染的细胞模型，并进一步通过小RNA测序和双荧光素酶报告基因实验，分析了病毒感染后触发的小RNA应答及其基因沉默功能。
Augmenting the MSRG pipeline with improved virus discovery
研究人员首先优化了病毒检测流程。面对公共病毒数据库（如GBVRL）中数据庞杂（例如超过53%是β-冠状病毒）导致的检索低效问题，MSRG流程采用BowTie比对工具，针对精心筛选的病毒列表进行分析。同时，他们引入VirusDetect软件对蚊虫小RNA进行从头组装，再比对到GBVRL、第三方向数据库（TPA）和宏基因组组装基因组（MAG）数据库，显著提高了新病毒的发现能力。例如，该方法成功区分了最初被误报的蝙蝠病毒和真正的虎蚊双分体番茄丛矮样病毒（TMBTLV），并发现了新的伊蚊双分体样病毒。最终，该分析为MSRG病毒列表新增了94种新病毒。
Widespread mosquito viruses can span continents while also displaying geographic boundaries
对美洲和亚洲样本的分析显示，一些昆虫病毒分布广泛，但同时也呈现出明显的地理界限。Phasi-Charoen样病毒（PCLV）和Humaita-Tubiacanga病毒（HTV）在美洲南部更常见，而埃及伊蚁传病毒（ANPHV）则偏向于美洲北部。佛罗里达、墨西哥和加勒比地区成为了这些病毒的“混合区”。此外，同一种病毒在不同样本中的vsmRNA丰度和链偏好性也存在显著差异。值得关注的是，许多在美洲发现的病毒（如HTV、PCLV、ANPHV）在亚洲样本中也同样存在，且其vsmRNA模式相似。
Dengue vsmRNAs identified in a wild Ae. aegyptiAsian isolate
尽管在登革热疫情发生地（如美国迈阿密、巴西）的蚊样本中未检测到登革热病毒（DENV）vsmRNA，但研究首次在一个来自新加坡的野生埃及伊蚊样本中发现了DENV1的vsmRNA。这些病毒小RNA中以小干扰RNA（siRNA）为主，与实验室感染蚊细胞产生的模式一致，表明该野生蚊虫携带了高载量的DENV1，从而激发了强烈的RNAi应答。
African Ae. aegypticolonies harbor a persistent African-specific mosquito virus
对非洲品系（主要是formosus亚种）的分析发现，它们携带一种非洲特有的、持续感染的新病毒——Formosus病毒（FORMV）。该病毒在至少12个非洲品系中均能检测到丰富的vsmRNA，且这些品系在实验室已传代多次，表明FORMV可通过垂直传播在蚊群中持续存在。FORMV的vsmRNA主要来自病毒基因组5‘端的NP、HP和GP基因的有义链，而RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）基因则似乎逃避了piRNA的产生，尽管其长链RNA转录本表达量很高。研究还观察到一些病毒piRNA的积累存在性别特异性差异。
Academic and commercial laboratory strains of Ae. aegypti
多数学术实验室常用的埃及伊蚊品系中昆虫病毒很少。然而，两个商业实验室品系（Benzon Research Labs和Bayer AG）却深度感染了TMBTLV，并产生了巨量的vsmRNA。这两个品系中TMBTLV的vsmRNA模式差异很大。在BZL品系的成蚊和卵中都检测到了相同的vsmRNA，证实了该病毒的垂直传播能力。
Mosquito viruses related to plant viruses lack matches to AedesEVE piRNAs
研究还发现了一些与植物病毒相关的蚊病毒，如双分体病毒（如Verdadero病毒）和番茄丛矮样病毒（如TMBTLV和Liverpool Tombus-like virus, LTLV）。有趣的是，这些与植物相关的蚊病毒似乎缺乏对应的伊蚊内源性病毒元件（EVE）来源的piRNAs。对已知EVE的分析显示，它们能产生针对诸如柑桔衰退相关病毒（CFAV）、ANPHV、Guadeloupe Totivirus（GTTV）和FORMV等病毒的反义piRNA，但未发现与植物相关蚊病毒匹配的EVE。
Insights into mosquito virus replication and RNAi dynamics from matched long RNA sequencing
通过对比配对样本的长链RNA和小RNA水平，研究人员深入了解了病毒复制与RNAi应答之间的动态关系。分析揭示了四种有趣的情况：1）内源性黄病毒元件1（AEFE1）在所有成虫样本中均显示小RNA多于长RNA；2）一些样本中病毒长RNA水平很高但vsmRNA很少（如伊蚊全病毒样病毒），表明病毒可能正在有效复制，而宿主的RNAi应答尚未完全启动；3）另一些样本则呈现相反的格局，即vsmRNA丰富而长RNA极少（如Entebbe品系中的FORMV），可能意味着病毒复制已被有效抑制；4）在BZL品系的卵中，多种病毒的长链RNA（包括正链和负链）水平极高，远超过其vsmRNA，这可能解释了为何尽管存在丰富的病毒piRNA和siRNA，病毒沉默似乎并不完全有效，从而允许了高效的垂直传播。
Infectious capacity of metagenomically assembled virus entries from RNA sequencing
为证实通过测序发现的病毒（如TMBTLV、FORMV）确实具有感染性，研究人员用蚊组织匀浆滤液对蚊细胞进行了连续盲传。经过5-6轮盲传后，他们利用RT-PCR在C6/36和Aag2细胞中稳定检测到了TMBTLV、Verdadero病毒、GTTV和FORMV的核酸，成功建立了稳定感染的细胞系。病毒感染动力学实验表明，TMBTLV和GTTV在C6/36细胞（其Dicer-2（Dcr2）基因有突变，抗病毒RNAi能力缺陷）中复制更快、更强；而FORMV则主要在Aag2细胞（具有完整的RNAi通路）中有效复制。这些蚊病毒无法在哺乳动物细胞（Vero E6, Huh7.5）中建立有效感染，证实了它们的昆虫特异性。
Stably infected mosquito cells generate strong vsmRNA responses that exert gene silencing activity
对稳定感染蚊细胞的小RNA测序显示，C6/36细胞对TMBTLV、ANPHV和FORMV均产生了强烈的病毒piRNA应答，且模式与原始蚊虫样本相似。由于Dcr2突变，C6/36细胞缺乏由病毒复制双链RNA中间体产生的常规siRNA。与之相反，感染TMBTLV的Aag2细胞（具有完整Dcr2）则产生了均匀覆盖整个病毒基因组的正、负链siRNA，这解释了TMBTLV在Aag2细胞中感染较慢的现象。然而，ANPHV和FORMV在Aag2细胞中主要产生有义链piRNA，这与在整蚊中的模式一致。通过双荧光素酶报告基因实验，研究人员首次直接证明了蚊虫vsmRNA具有基因沉默功能。将含有FORMV或TMBTLV特定片段的反义（AS）序列插入报告基因3‘UTR后，其在病毒感染的细胞中的表达被显著抑制，而含有有义（S）序列的报告基因则不受影响，表明细胞中大量存在的有义链vsmRNA能够有效介导对互补靶标的沉默。
研究结论与重要意义
本研究通过大规模的病毒小RNA（vsmRNA）组学调查，极大地扩展了已知能感染埃及伊蚊并激发其RNA干扰（RNAi）免疫应答的昆虫病毒目录。研究揭示了这些病毒复杂的地理分布模式，既有横跨大陆的广泛传播，也存在清晰的地理边界。首次在野生蚊虫中直接捕获到登革热病毒激发的RNAi应答信号，为理解自然感染状态下病毒-宿主的相互作用提供了珍贵样本。研究还发现了一个非洲特有的、能在蚊群中垂直传播并持续存在的Formosus病毒（FORMV）。
更为重要的是，研究通过实验证实，通过组学方法发现的这些病毒序列确实代表具有感染性的活病毒，它们能够稳定感染多种蚊细胞系，并触发产生具有生物活性的vsmRNA。这些vsmRNA（特别是piRNA和siRNA）不仅是一个被动的免疫应答标记，更能主动介导基因沉默，这为理解蚊子如何抵抗病毒感染提供了潜在的分子机制解释。
该研究建立的vsmRNA组学方法，为传统的媒介病毒监测提供了强有力的补充。它不仅能发现新的、潜在重要的昆虫病毒，还能通过vsmRNA的水平间接反映病毒感染的活性与强度，以及宿主免疫系统的应答状态。这对于评估蚊群中病毒的持久感染、追踪潜在的新发病毒威胁、以及深入研究昆虫病毒与蚊媒传播的人类病原体之间的互作，都具有重要的科学意义和应用价值。
