环脱氨肽Xylaroamide A的全合成 吴荣平、 邱东平、 Yogini S. Jaiswal、 谢欣荣、 Leonard L. Williams、 范瑜、 边贺东、 关益夫、 苏少阳

《Chemistry》：Total Synthesis of Cyclodepsipeptide Xylaroamide A Rongping Wu, Dongping Qiu, Yogini S. Jaiswal, Xinrong Xie, Leonard L. Williams, Yu Fan, Hedong Bian, Yifu Guan and Shaoyang Su

　　摘要：环肽是一类结构多样的天然产物，由氨基酸和羟基酸残基通过酰胺键和酯键连接而成。其中，木糖酰胺A是一种环状七肽，最近通过分子网络指导敲发现方法从一种内生地衣菌属（Xylaria）中鉴定出来。尽管木糖酰胺A具有有趣的结构和显著的生物活性潜力，但其全合成尚未被探索。本文报道了首次木糖酰胺A的全合成，采用了一种固态/溶液相混合的合成方法。线性前体根据天然氨基酸序列通过Fmoc基团的固相肽合成法制备，并在后期加入预先组装好的酯片段。随后在高压稀释条件下进行大环化，得到目标环肽。合成产物的结构通过旋光光谱和NMR及MS光谱分析得到确认，与已报道的天然产物数据吻合良好。这项工作建立了一种可靠且高效的木糖酰胺A合成路线，为进一步的生物活性和结构优化研究奠定了基础。

1. 引言
环肽是一类重要的天然产物，已从包括藻类、陆地植物和海洋物种在内的多种生物中分离出来[1,2,3,4]。在这些分子中，一个或多个氨基酸残基被羟基酸取代，从而在大环框架内形成酯键[5,6,7]。这种结构特征赋予了它们显著的分子多样性，并经常与抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗疟疾和抗锥虫等生物活性相关[8,9,10,11]。由于这些性质，环肽作为治疗药物和农用化学品的潜在先导结构受到了持续关注[12,13,14,15,16]。

木糖酰胺A（图1）是一种最近从地衣来源的内生地衣菌属物种中通过MS/MS分子网络方法发现的环状七肽。其结构包含一个由六个氨基酸残基和一个α-羟基酸单元（(S)-2-羟基-3-苯丙酸（L-Ph-Lac）组成的21元大环，通过酯键连接。肽骨架包括三个L构型残基（L-Leu，两个L-Pro）和三个D构型残基（D-Leu，D-Ile，N-Me-D-Leu），赋予了明显的立体化学复杂性。D型和L型氨基酸的组合增强了构象刚性[18]，而N-甲基化的D-亮氨酸残基可能提高了蛋白酶稳定性并促进了构象预组织。生物评价显示，木糖酰胺A具有强大的抗癌活性，能够抑制HT29和RKO（结肠）、H1299和PC-9（肺）以及BT-549（三阴性乳腺癌）细胞系的增殖，IC50值为2.5–12 μM。值得注意的是，BT-549细胞对木糖酰胺A最敏感（IC50 = 2.5 μM），其活性超过了顺铂（IC50 = 8.6 μM），而正常人乳腺上皮细胞受影响较小，表明其具有选择性。这些结果突显了其作为三阴性乳腺癌治疗药物先导化合物的潜力。

尽管木糖酰胺A具有有趣的结构特征和有希望的生物活性，但至今尚未通过化学合成方法获得。由于其含有肽键、多个立体中心以及一个N-甲基化残基，合成上存在相当大的挑战。此外，天然产物的有限可用性限制了进一步的生物研究和结构-活性关系的探索。这些考虑促使我们探讨了一种实用的合成方法。本文描述了首次木糖酰胺A的全合成，为进一步的生物评估和结构-活性优化提供了可靠的平台。

2. 材料与方法
2.1 材料
所有商业可得的试剂均从商业供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。所有试剂和溶剂均为试剂级或HPLC级。1H/13C NMR谱是在Bruker光谱仪上以400/100 MHz的频率（美国马萨诸塞州Billerica）在指定溶剂中记录的。化学位移（δ）以ppm表示，参考溶剂信号（DMSO：1H：2.54 ppm，13C：40.45 ppm；CDCl3：1H：7.26 ppm；13C：77.00 ppm），偶联常数（J）以Hz表示。多重性的标准缩写如下：brs = 宽单峰，s = 单峰，d = 双峰，t = 三峰，m = 多峰。所有NMR实验均使用供应商提供的标准脉冲序列进行。薄层色谱（TLC）是在涂有0.25 mm层硅胶60的Whatman玻璃板上进行的。柱层析是在中国青岛青岛海洋化学分子厂的硅胶（200–300 mesh）上进行的。质谱仪购自美国香港Agilent Technology有限公司。红外光谱（IR）是在400–4000 cm?1范围内使用Magna-IR 550光谱仪（美国马萨诸塞州Waltham）收集的。

2.2 酯构建块4的合成
在一个装有磁力搅拌棒的25 mL圆底烧瓶中加入(S)-2-羟基-3-苯丙酸（1.0 g，6.0 mmol，1.0当量）、Cs2CO3（2.2 g，6.6 mmol，1.1当量）和无水DMF（4.0 mL）。所得白色悬浮液在室温下搅拌40分钟，然后冷却至0°C。通过注射器在5分钟内逐滴加入苯基溴（0.7 mL，6.1 mmol，1.0当量）。反应混合物在0°C下搅拌1小时后升温至室温并再搅拌18小时。通过加入水（20.0 mL）终止反应，然后转移到分离漏斗中。水相用乙酸乙酯（3 × 45 mL）萃取。合并的有机层依次用饱和NaHCO3（40.0 mL）、水（40.0 mL）和盐水（20.0 mL）洗涤，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯 = 8:1，v/v）纯化，得到无色油状化合物5（1.6 g，95.2%）。

2.3 木糖酰胺A的合成
2.3.1 将Fmoc-D-异亮氨酸装载到2-CTC树脂上以合成9A
将2-氯三苯甲基氯树脂（CTC树脂，0.30 g，装载量：1.18 mmol/g）加入25 mL的烧瓶中。将树脂在室温下用DCM（10 mL）预浸30分钟，然后使用Pasteur吸头吸除溶剂。接着向膨胀的树脂中加入Fmoc-D-异亮氨酸（0.38 g，3.54 mmol，3.0当量）和咔唑（0.30 mL，2.27 mmol，6.0当量）在无水DCM（8.0 mL）中的溶液。悬浮液在室温下搅拌8小时以使氨基酸固定在树脂上。完成后，排出反应混合物，并用DCM（3 × 5 mL）和DMF（3 × 5 mL）依次洗涤树脂。未反应的位点用DCM/MeOH/DIPEA溶液（17:2:1，v/v，10 mL）处理50分钟进行封闭。随后用DCM（3 × 5 mL）和DMF（3 × 5 mL）交替洗涤树脂，得到装载完成的树脂，准备进行后续链延伸。

2.3.2 在树脂上合成链肽
2.3.2.1 氨基酸的偶联
将Fmoc-D-亮氨酸（0.39 g，1.06 mmol）、HATU（0.40 g，1.06 mmol）和DIPEA（0.60 mL，3.40 mmol）在无水DMF（2 mL）中的溶液加入树脂中，并在室温下振荡3小时。完成后，排出反应混合物，用DCM（3 × 5 mL）和DMF（3 × 5 mL）依次洗涤树脂，得到2-氯三苯甲基氯树脂结合的二肽。

2.3.2.2 肽链的延伸
依次使用Fmoc-N-甲基-亮氨酸（1.06 mmol）、Fmoc-L-脯氨酸（1.06 mmol）和构建块4（1.06 mmol）进行上述偶联和延伸步骤。最后，用20%哌啶在DMF（2 × 10 min）处理去除末端Fmoc保护基团。然后用DCM（3 × 5 mL）和DMF（3 × 5 mL）交替洗涤树脂，得到完全组装的七肽。

2.3.3 从树脂上切割肽以合成2
将树脂结合的肽10用0.5%三氟乙酸在DCM（7.50 mL）中的切割溶液处理，并在振荡器中搅拌20分钟。然后将切割溶液转入100 mL圆底烧瓶中，用DCM（3 × 5 mL）洗涤树脂。重复该切割/洗涤步骤两次，确保完全切割。将合并的有机相在减压条件下浓缩，得到粗肽11（Rf = 0.25，DCM/MeOH = 5:1，v/v），为一种淡黄色固体，直接用于后续步骤而无需进一步纯化。将粗肽11溶解在25 mL圆底烧瓶中的2.0 mL DCM中，并冷却至0 °C。然后逐滴加入三氟乙酸（2.0 mL），搅拌反应混合物30分钟以去除Boc保护基团。完成后，在氮气保护下浓缩反应混合物，得到完全去保护的线性肽2。接着用冷乙醚沉淀并洗涤，得到粗产品。由于肽2和肽11直接用于后续反应而未经纯化，因此没有收集这些中间体的光谱特征数据。

2.3.4. 向Xylaroamide A的环化
将粗线性肽2（0.10 g，0.12 mmol，1.0当量）溶解在250 mL圆底烧瓶中的80 mL DCM中。在搅拌下逐滴加入HATU（0.09 g，0.24 mmol，2.0当量）和HOAt（0.03 g，0.24 mmol，2.0当量）的无水DMF溶液。将反应混合物冷却至0 °C，然后逐滴加入DIPEA（94 μL，0.54 mmol，4.5当量）。然后让反应混合物升温至室温并搅拌48小时。完成后，用0.1 M HCl（60 mL）淬灭反应，并用DCM萃取（3次，每次60 mL）。合并的有机萃取物依次用饱和NaHCO3（2次，每次20 mL）和盐水（2次，每次30 mL）洗涤，然后用无水Na2SO4干燥，减压浓缩得到淡黄色油状物。通过制备型反相HPLC在YMC-Pack C18柱（YMC，京都，日本）上纯化得到的环化产物（ODS-A，12 nm，5 μm粒径）。洗脱液使用甲醇/水（80:20，v/v），流速为2 mL/min，在215 nm处监测，目标化合物在9.1分钟处洗脱。每次进样2 mg。收集的组分合并后在减压条件下浓缩，从化合物8中获得8.1%产率的所需环肽，HPLC纯度为97.5%（图S14）。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.29（d，J = 6.7 Hz，1H），7.60（d，J = 9.3 Hz，1H），7.23（重叠，1H），7.22（重叠，2H），7.05（重叠，2H），7.04（d，J = 7.0 Hz，1H），5.07（dd，J = 4.1, 11.4 Hz，1H），4.91（dd，J = 6.6, 1.9 Hz，1H），4.78（t，J = 7.7 Hz，1H），4.56（t，J = 10.5 Hz，1H），4.54（m，1H），4.20（dd，J = 1.8, 9.1 Hz，1H），4.09（t，J = 7.2 Hz，1H），3.79（dt，J = 1.6, 7.5 Hz，1H），3.61（dt，J = 2.2, 8.9 Hz，1H），3.50（重叠，1H），3.47（重叠，1H），3.30（dd，J = 6.4, 14.2 Hz，1H），2.94（s，3H），2.15（m，2H），1.91（m，1H），1.81（m，1H），1.74（m，1H），1.73（m，1H），1.71（m，1H），1.63（m，1H），1.61（m，1H），1.58（m，1H），1.55（m，2H），1.52（m，1H），1.35（m，2H），1.33（m，2H），1.29（m，1H），1.16（m，1H），1.09（m，1H），0.96（重叠，3H），0.89（d，J = 6.4 Hz，3H），0.87（d，J = 6.6 Hz，3H），0.85（m，3H），0.83（d，J = 6.3 Hz，3H），0.83（t，J = 6.9 Hz，3H），0.81（d，J = 5.8 Hz，3H），0.77（d，J = 6.5 Hz，3H）。
13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：174.05, 172.91, 170.45, 170.30, 169.85, 168.55, 168.21, 135.37, 129.45, 128.08, 126.84, 74.48, 59.51, 56.26, 55.73, 54.37, 50.08, 49.85, 46.79, 45.98, 41.10, 38.02, 35.44, 35.27, 34.42, 30.63, 27.85, 26.11, 25.12, 24.59, 24.36, 23.84, 23.71, 23.38, 23.33, 23.27, 21.83, 20.99, 20.66, 15.17, 11.82。
ESIMS：m/z [M + Na]+ 计算值：C44H68N6NaO8，831.5；实测值：831.5。

2.3.5. Xylaroamide A的光学旋转测量
使用Rudolph Autopol IV自动极化仪（Rudolph，Research Analytical，Hackettstown，NJ，USA）在589 nm和25 °C下测量合成Xylaroamide A的光学旋转，溶剂为甲醇。将化合物溶解至0.1 g/100 mL的浓度，记录比旋光度为[α]25D = ?7.8。

3. 结果与讨论
3.1. Xylaroamide A的合成
仔细优化至关重要，以最小化竞争性副反应，包括C端环化、环状寡聚化和分子间聚合，这些反应会显著降低产率和纯度。空间阻碍最小的环化位点通常提供更高的效率，而脯氨酸残基由于其构象刚性，有助于促进大环化，从而降低熵障碍。此外，包含交替D-和L-氨基酸或能够形成分子内氢键的肽序列可能会采取预先组织的构象，进一步提高环化效率[20]。
在对Xylaroamide A的逆合成分析中，选择合适的环化位点至关重要，因为它决定了线性前体序列并直接影响大环化效率。考虑了几种潜在的断开位点。通过酯键形成（大内酯化）进行大环化预计会比通过酰胺键形成更具挑战性且效率更低。因此，选择了D-Ile和L-Pro残基之间的键作为环化位点，使得通过分子内大内酯化实现大环结构。此外，该位点还有利于相邻的脯氨酸残基帮助预组织肽骨架，促进环闭合。基于这一策略，确定线性前体2为关键中间体。进一步断开L-Ph-Lac和L-Leu残基可以得到肽3和酯片段4，这两种都可以从商业可获得的构建块组装，包括D-allo-Ile、D-Leu、N-Me-D-Leu、L-Pro、L-Leu和L-Ph-Lac（图2）。
图2. Xylaroamide A的逆合成分析。
由于在肽合成中酯键形成通常更具挑战性，因此早期就制备了酯片段4。首先用碳酸铯将L-Ph-Lac苄基化，得到相应的苄基酯5，产率为95.2%。随后与Boc-L-Pro 6顺利偶联，得到中间体7，产率为90.5%[19]。最后，通过催化氢解去除苄基保护基团，得到所需的酯片段4，产率为98.3%（方案1）。为了进一步验证中间体7的绝对构型是否从其起始材料保持不变，将(±)-Ph-Lac进行相同的合成步骤，得到7的非对映体混合物。然后将非对映体混合物与中间体7（纯度：95.7%，图S11）合并，HPLC分析显示在相同保留时间处出现一个峰，确认在酯键形成过程中手性中心保持不变（图S12）。
方案1. 酯片段4的合成路线。
有了酯片段4，重点转移到线性前体2的组装上。肽合成通常可以通过溶液相或固相方法实现，每种方法适用于不同结构复杂度[21,22,23,24]。溶液相合成常常受到寡聚化、C端环化和繁琐纯化问题的影响[25]。相比之下，固相合成（SPPS）简化了纯化过程并限制了分子间副反应，特别适合组装复杂的肽序列。在SPPS方法中，Boc/苄基策略需要强酸性条件（HF）进行全局脱保护[26,27]，而Fmoc/tBu协议使用碱性不稳定的Fmoc保护和酸性不稳定的侧链保护基团，允许更温和且操作方便的脱保护步骤[28]。考虑到HF的安全问题，选择了Fmoc/tBu SPPS方法来合成线性前体2。
线性组装首先在偶氮二氰尿酸（2-CTC）树脂上加载Fmoc-D-Ile，在柯林idine存在下，得到相应的氨基酸负载树脂9（方案2）[29,30]。随后在DIPEA存在下用MeOH封盖树脂上剩余的活性位点，以避免链延伸过程中的不良副反应。通过连续的Fmoc脱保护（DMF中的20%哌啶）然后使用HATU/DIPEA偶联下一个Fmoc保护的氨基酸，实现了有效的链延伸[31]。值得注意的是，也评估了其他偶联试剂如DCC/HOBt、HBTU和EDCI/HOBt，但转化不完全，而HATU始终提供了更高的偶联效率，特别是对于空间受阻的残基如N-Me-D-Leu。肽序列通过依次加入Fmoc-D-Leu、Fmoc-N-Me-D-Leu、Fmoc-L-Pro和Fmoc-L-Leu，然后偶联酯片段4，最终得到完全组装的树脂结合肽10（方案2）。
图2. Xylaroamide A的合成。
在温和的酸性条件（DCM中的0.5% TFA）下，将树脂结合的肽10从2-CTC树脂上切割下来。然后用DCM中的50% TFA去除N端Boc基团，得到粗线性肽2，通过沉淀和冷乙醚洗涤获得。随后在高压稀释条件下进行大环化，以最小化分子间寡聚化。在无水DMF中，室温下用HATU/HOAt处理线性肽2和DIPEA48小时，得到所需的大环产物。LC-MS监测环化反应未发现与Xylaroamide A相同分子量的额外峰，表明环化步骤中没有发生可检测的环化。通过制备型反相HPLC纯化后，从初始的Fmoc-D-Ile中获得8.1%产率的环肽1。
还评估了其他偶联条件，包括HBTU/DIPEA和EDCI/HOBT；然而，所有这些条件的产率都低于HATU/HOAt系统。

3.2. 通过NMR、MS和光学旋转比较合成和天然Xylaroamide A
将合成Xylaroamide A的NMR光谱数据与报道的天然Xylaroamide A的数据进行了详细比较（表1）。1H NMR谱显示了相同的信号模式和多重性，化学位移偏差（Δδ）小于0.04 ppm。同样，13C NMR信号在所有共振峰上的偏差不超过0.2 ppm。质谱分析进一步显示分子离子峰与计算值一致。此外，固相肽合成已知能有效减少肽键形成过程中的外消旋现象，支持合成化合物的立体化学完整性。此外，在相同条件下，合成Xylaroamide A的光学旋转为?7.8，与其天然对应物（?8.0）相符[17]。综上所述，这些结果确认合成Xylaroamide A与天然产物相同。

4. 结论
总之，我们首次实现了Xylaroamide A的全合成。我们的策略结合了溶液相制备关键含酯构建块和逐步基于Fmoc的固相肽合成来构建线性肽前体。通过控制实验确认了关键酯构建块的绝对构型。优化的分子内大内酯化高效地得到了目标大环结构。通过光学旋转和NMR及MS分析完全确认了合成Xylaroamide A的结构，与天然产物一致。这项工作为Xylaroamide A的合成和生物学研究提供了可靠的方法。

补充材料
以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/chemistry8050055/s1
图S1：化合物5的1H NMR谱；图S2：化合物7的1H NMR谱；图S3：化合物7的13C NMR谱；图S4：化合物4的1H NMR谱；图S5：化合物4的13C NMR谱；图S6：合成Xylaroamide A的1H NMR谱；图S7：合成Xylaroamide A的13C NMR谱；图S8：化合物7的HRMS；图S9：化合物4的HRMS；图S10：合成Xylaroamide A的MS；图S11：化合物7的HPLC纯度分析；图S12：非对映体7 + 化合物7的HPLC分析；图S13：化合物4的HPLC纯度分析；图S14：合成Xylaroamide A的HPLC纯度分析。