彩色棉与陆地棉镰孢菌萎凋病抗性的分子表征及SSR标记JESPR220的验证与应用

《Journal of Natural Fibers》：Molecular Characterization of Fusarium Wilt Resistance in Naturally Colored and Elite Upland Cotton Germplasm

为解决全球棉花生产中由镰孢菌萎凋病(Fusarium wilt, FOV)引起的重大病害问题，本研究针对天然彩色棉和陆地棉(Gossypium hirsutum L.)种质，通过人工接种FOV 4号生理小种，评估了其抗性表型，并验证了SSR标记JESPR220在标记辅助选择(MAS)中的应用价值。结果显示，JESPR220标记的145 bp等位基因与抗病性显著相关，携带该等位基因的基因型平均病害指数(DI)为1.34，显著低于不携带者(4.26)，该标记可解释84%的表型变异(r = -0.917)。该标记为棉花抗病育种提供了高效可靠的早期筛选工具，有助于加速抗病品种的选育。

　　

棉花是全球农业经济的支柱，为世界提供超过35%的天然纤维，支撑着价值数十亿美元的纺织和油籽产业。然而，这种至关重要的作物持续受到土传维管束病原体的威胁，其中由尖孢镰刀菌萎凋专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, FOV)引起的镰孢菌萎凋病(Fusarium wilt, FW)尤为严重。自1892年在美国阿拉巴马州首次被描述以来，FOV已分化为至少8个经典生理小种(1-8)和多个基因型。其中，高毒力的4号生理小种(FOV 4)在20世纪90年代末出现在美国加利福尼亚州，随后传播至新疆、澳大利亚和中亚地区，成为当代流行病的主要驱动者。在受侵染的田地中，产量损失通常达到20%-60%，在严重暴发时，整个植株可能在初花前就被毁掉。此外，气候变化导致的变暖预计将通过促进土壤中微菌核的存活而进一步加剧病害压力。

栽培和化学防治只能提供部分缓解。甲基溴熏蒸已被禁用，而较新的杀菌剂木质部移动性有限，使得种植前土壤浸灌成本高昂。因此，寄主植物抗性仍然是综合FW管理的基石。然而，通过常规育种开发抗病品种一直具有挑战性，因为FW抗性通常是数量性状，由几个具有中等遗传力的加性位点控制。因此，通过表型选择的进展缓慢，并且受到环境特异性病害表达和需要检疫级接种设施的限制。

分子标记的出现彻底改变了棉花遗传学。利用重组自交系、染色体替换系和多亲本高级世代互交(MAGIC)群体，已在17条染色体上定位了20多个FW抗性的数量性状位点(QTL)。值得注意的是，SSR标记JESPR220 (D03)和BNL3255 (D02)侧翼是主效QTL，可解释高达35%的对FOV 3/4的表型变异。在包含355个材料的群体中进行的关联作图进一步验证了145-bp的JESPR220等位基因是抗病地方品种中富集的单倍型，证明了标记辅助选择(MAS)的实用性。JESPR220和BNL1604 SSR标记已被用于提高乌兹别克斯坦和美国优良背景下的FW抗性和纤维品质，证实了MAS的实际应用价值。

然而，一个主要的认知缺口是，标记在来自多样外源和地方种质（这些材料通常具有超亲抗性但缺乏分子表征）的新育种群体中的表现。评估此类多样的遗传资源是现代棉花改良的关键优先事项。此外，先前的大多数研究孤立地评估标记或表型；很少有研究在统一条件下整合并行的基因分型和人工接种来验证等位基因与性状的关联。

在乌兹别克斯坦，棉花种植面积超过一百万公顷，过去十年中FOV流行病加剧，每年造成超过5000万美元的经济损失。先前的调查显示，农民田地里抗病品种极度缺乏，并确定为可靠的感病指示品种。因此，本研究旨在通过使用包含32个基因型（包括优良品系和F₃杂交种）的多样化面板来解决这些缺口。目标是：(i) 在人工接种乌兹别克斯坦强毒FOV 4分离株的条件下，对该面板进行表型分析；(ii) 使用JESPR220对所有材料进行基因分型以确定等位基因分布；(iii) 量化标记-性状关联的强度和一致性；(iv) 确定适合MAS部署的候选亲本系。通过将严格的病理学筛选与基因分型相结合，本研究为在资源有限和病害压力不断升级的情况下，棉花育种计划中快速导入FOV抗性提供了一个可操作的流程。

为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法。首先，研究使用了一个多样化的陆地棉(Gossypium hirsutum L.)种质面板，包括天然彩色棉品系、优良白纤维品种和F₃杂交后代，这些材料均来源于乌兹别克斯坦塔什干棉花育种、种子生产和农业技术研究所(CBSPARI)的种质库。其次，在受控温室条件下，采用根部浸蘸法，使用从乌兹别克斯坦布哈拉地区分离得到的高毒力FOV 4号生理小种分离株，对处于两片真叶期的棉花幼苗进行人工接种。病害严重程度采用0-5分制的病害指数进行评估。最后，通过CTAB法从幼苗叶片中提取基因组DNA，并使用SSR标记JESPR220对所有基因型进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析，以检测特定的等位基因片段。

Significant variation in fusarium wilt resistance across cotton genotypes

通过对32个棉花基因型进行人工接种FOV 4号生理小种，观察到其抗病性存在显著差异。病害指数在0.5至接近5.0之间变化，其中7个基因型被归类为高抗，14个为中抗，8个为高感。感病指示品种的病害指数最高（接近5.0）。方差分析表明基因型间病害反应差异极显著(F_31,288= 93.5, p < .0001)。此外，直观展示了在感染条件下抗病和感病幼苗的表型对比。

A single SSR allele strongly predicts fusarium wilt resistance

利用SSR标记JESPR220对所有基因型进行基因分型，发现了三个不同的等位基因（约130 bp、145 bp和160 bp）。研究发现，145 bp等位基因与抗病性存在极强的关联。携带该等位基因的24个基因型的平均病害指数(DI)为1.34，而8个不携带该等位基因的基因型的平均DI为4.26，两者差异极显著（韦尔奇t检验，p = 1.8 × 10^-10）。皮尔逊相关系数(r)为-0.917，表明该标记解释了约84%的表型变异。琼脂糖凝胶电泳图谱清晰显示了抗病基因型携带的145 bp条带，。

Multivariate analysis (PCA and clustering)

主成分分析(PCA)结果显示，第一主成分(PC1)解释了总方差的80.7%，并且与病害指数和145 bp等位基因的存在高度相关。所有携带145 bp等位基因的24个抗病基因型聚集在PC1负值区，而不携带该等位基因的8个感病基因型聚集在PC1正值区，两者完全分离。层次聚类分析产生了类似的结果，将所有基因型清晰地分为两个主要簇，一个包含所有不携带145 bp等位基因的感病基因型，另一个包含所有携带该等位基因的基因型。这些多元统计分析提供了强有力的证据，表明JESPR220标记（特别是145 bp等位基因的存在与否）是区分该棉花种质群体中镰孢菌萎凋病抗感性的主要因素。

研究结论与重要意义

本研究的统计分析揭示了JESPR220标记的145 bp等位基因与对所用强毒FOV 4号分离株的抗性之间存在显著相关性，携带该等位基因的基因型表现出显著更低的病害指数。这一强负相关(r = -0.917)表明，在该特定种质面板中，此标记是表型的可靠预测因子。该结果与先前报道一致，即JESPR220是染色体D03上一个主效QTL（通常与源自海岛棉G. barbadense L.渐渗的Fov4基因相关）的侧翼标记。研究中所有高感病品系均缺乏145 bp等位基因，这解释了本研究中观察到的高决定系数(R²= 84%)。然而，感病地方品种中普遍存在的130 bp等位基因表明，该抗性等位基因可能是一种尚未在乌兹别克斯坦优良棉花种质中广泛固定的渐渗片段。

尽管本研究数据集中相关性很高，但仅依赖JESPR220意味着存在必须解决的风险，以避免高估单个位点的作用。棉花镰孢菌萎凋病抗性在历史上被描述为由多个加性位点控制的数量性状。例如，先前研究在染色体A6、D4和D6上鉴定出抗性QTLs，分别解释了9%至41%的表型变异，这表明该性状的复杂性超出了一个单一位点。虽然JESPR220连锁位点似乎是针对本研究使用的强毒4号生理小种抗性的主要决定因素，但它并未涵盖全部遗传潜力。在抗病F₃家系中观察到的微小分离表明，背景遗传效应和杂合性仍然影响着表型。

为实现持久抗性，育种策略必须从单标记选择转向基因聚合。依赖单个主效基因会对病原体施加高选择压力，可能导致抗性被病原体克服。持久抗性可能需要将JESPR220连锁的QTL与其他位点结合。有趣的是，JESPR220的用途可能超出抗病性。有研究发现JESPR220与籽棉产量和皮棉产量存在显著的标记-性状关联。这表明可能存在连锁或基因多效性效应，即选择JESPR220抗性等位基因可能同时有利于产量性状，或至少避免了抗性育种计划中常见的产量拖累问题。

这些发现的实际应用是在早期育种周期中利用显著的负相关性进行负向选择。主成分分析中两组基因型的明显分离支持使用JESPR220在苗期阶段自信地淘汰非携带者，从而节省资源用于田间评估携带者。然而，这些标记的存在不能替代表型验证。基因型与环境互作显著影响病害表达，在受侵染土壤中进行田间试验对于确认标记相关性在不同接种量和环境胁迫下是否成立至关重要。

总之，虽然JESPR220与FW抗性之间的显著相关性使其成为针对特定4号生理小种的高度有效的诊断工具，但它并非独立解决方案。将其整合到更广泛的选择指数中，辅以田间筛选和其他抗性基因的聚合，将显著加速抗病棉花品种的选育进程。本研究发表在《Journal of Natural Fibers》上。