来自海带（Laminaria japonica）和紫菜（Porphyra）的硫酸化多糖能够抑制SARS-CoV-2的主要蛋白酶：对分子相互作用的机制性见解

《Bioorganic Chemistry》：Sulfated polysaccharides from Laminaria japonica and Porphyra inhibit SARS-CoV-2 main protease: mechanistic insights into molecular interactions

硫酸化多糖抑制SARS-CoV-2主蛋白酶活性研究：发现Laminaria japonica来源的IJSPS对Mpro具有显著抑制效果（IC50=1.17±0.34 nM），其抑制机制涉及氢键和范德华力相互作用，并形成稳定复合物，优于传统抗病毒药物硫酸软骨素和肝素。

　　

Jinwen Li|Shu Jie Li

天津南开大学物理科学学院凝聚态与材料物理系，中国天津300071

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）在宿主细胞中的复制依赖于其非结构蛋白——主要蛋白酶（M^pro），这是一种半胱氨酸蛋白酶，也是抗病毒药物设计的主要靶点。本研究探讨了来自海带（Laminaria japonica）的硫酸化多糖（IJSPS）和紫菜（Porphyra）的硫酸化多糖（PSPS）对M^pro活性的抑制作用。结果表明，IJSPS对M^pro活性具有显著的抑制效果，而PSPS则没有这种效果。IJSPS对M^pro活性的半数最大抑制浓度（IC₅₀）为1.17?±?0.34?nM，抑制常数（K_i）为1.05?nM，其抑制效果明显强于软骨素硫酸盐和肝素。荧光淬灭实验表明，这两种硫酸化多糖通过与M^pro的氢键和范德华力相互作用。在25 °C和0.15?M盐浓度下，IJSPS和PSPS与M^pro的解离常数（K_D）分别为7.82和8.33?μM。此外，分子对接和分子动力学（MD）模拟表明，IJSPS可能结合到M^pro的活性位点区域并与其形成稳定的复合物，为实验结果提供了理论支持。我们的发现表明，来自海带的硫酸化多糖对SARS-CoV-2的M^pro具有强烈的抑制作用，这突显了它们作为功能性食品成分在抗病毒防御和维持宿主健康方面的潜力。

引言

冠状病毒是一种RNA病毒，迄今为止已发现只有七种能够引起人类从轻微感冒到严重呼吸窘迫综合征等多种呼吸道感染。SARS-CoV-2感染可导致肺部炎症、呼吸困难，甚至肾衰竭和死亡[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。SARS-CoV-2的基因组大小约为29.9?kb，包含约30,000个核苷酸。基因组的约三分之二由两个开放阅读框（ORF1a和ORF1ab）编码非结构蛋白，而靠近3′端的区域编码结构蛋白[6]。SARS-CoV-2含有四种结构蛋白S、E、M和N，以及十六种非结构蛋白NSP1-NSP16[7]、[8]。

SARS-CoV-2的主要蛋白酶（M^pro）是病毒复制和组装所必需的两种半胱氨酸蛋白酶之一。M^pro酶由306个氨基酸残基组成，包含三个结构域：结构域I（残基8–101）、结构域II（残基102–184）和结构域III（残基201–303）。结构域I和II具有反平行的β桶状结构，而结构域III通过一个长环区域（残基185–200）与结构域II相连。结构域I和结构域II之间的间隙是底物结合口袋，其特征是催化残基His41和Cys145以及Cys-His催化二聚体[9]。在所有冠状病毒中，M^pro蛋白的活性位点高度保守，由四个位点S1’、S1、S2和S4组成[5]、[9]、[10]。SARS-CoV-2的ORF1ab由宿主核糖体翻译成两种多聚蛋白PP1a和PP1ab，这些多聚蛋白随后被病毒的M^pro蛋白（M^pro的结构类似于小RNA病毒中的3C蛋白酶，因此也称为3CL^pro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL^pro）切割。PL^pro切割前三个N端位点，而M^pro切割剩余的11个N端位点，形成15种非结构蛋白（NSPs）[6]、[11]、[12]。M^pro识别的序列包含Leu-Gln-(Ser/Ala/Gly)，切割位点位于Gln残基之后[13]、[14]。M^pro没有人类同源物，是设计抗冠状病毒药物的主要靶点。最近的计算机模拟研究还探索了来自植物的生物活性分子对多个SARS-CoV-2靶点（包括M^pro、RdRp和Nsp15）的作用，进一步强调了基于对接和模拟的方法在抗病毒先导化合物发现中的实用性[15]、[16]、[17]、[18]。

硫酸化多糖是通过在多糖分子链的单糖羟基上替换硫酸基团形成的，例如来自海带和紫菜的硫酸化多糖、软骨素硫酸盐和肝素（图1）[19]、[20]、[21]、[22]。来自食品和药用来源的天然多糖因其多样的生物活性而受到越来越多的关注，其功能特性通常与分子组成、分子量和取代模式等结构特征密切相关[23]、[24]。使用含有SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒评估了来自褐藻的硫酸化多糖的抗病毒活性，发现这种多糖对假病毒S蛋白的活性具有抑制作用[25]。同时，来自多种海洋来源的硫酸化多糖（包括褐藻和紫菜）已被证明对SARS-CoV-2假病毒（Wuhan Hu-1）和Delta（B.1.617.2）野生型S蛋白株具有抑制作用[26]。一些研究还发现，软骨素硫酸盐E与SARS-CoV-2 S蛋白的结合可能影响SARS-CoV-2活性的抑制[27]。未分类的肝素（UFH）通过抑制SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD结构域与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合而具有抗病毒作用[28]、[29]。UFH和低分子量肝素（LMWH）在阻断SARS-CoV-2 S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合方面的抗病毒活性也通过Vero E6细胞上的斑块抑制实验得到了验证[28]、[30]。

A、B、C和D：四种硫酸化多糖重复单元的化学结构。软骨素硫酸盐和肝素的重复单元根据硫酸酯基团的位置而有所不同。

综合这些考虑因素，为本研究提供了依据。鉴于SARS-CoV-2的M^pro是一个有吸引力的抗病毒靶点，且硫酸化多糖具有特征性的硫酸基团、已报道的抗病毒相关活性和蛋白质结合潜力，我们旨在研究结构不同的海藻来源的硫酸化多糖对M^pro的抑制作用，并阐明其相互作用机制。

我们之前的研究表明，肝素和软骨素硫酸盐通过竞争性抑制显著抑制SARS-CoV-2的M^pro活性[21]、[22]。在这里，我们研究了来自海带和紫菜的硫酸化多糖对SARS-CoV-2的M^pro活性的抑制作用，并比较了四种硫酸化多糖（SPS）对M^pro活性的抑制效果。我们发现，来自海带（LJSPS）的硫酸化多糖对M^pro活性具有显著的抑制效果，而来自紫菜（PSPS）的硫酸化多糖几乎没有效果。为了阐明抑制机制，我们利用蛋白质荧光淬灭结合分子对接和分子动力学模拟来研究这两种多糖与M^pro蛋白之间的相互作用以及多糖-M^pro复合物的结构稳定性。结果表明，硫酸化多糖可以通过抑制SARS-CoV-2的M^pro活性来抑制病毒复制。这些发现突显了可食用海藻来源的多糖作为功能性食品成分在抗病毒防御和维持宿主健康方面的潜力。

化学物质和试剂

来自海带（LJSPS）和紫菜（PSPS）的硫酸化多糖由山东杰晶集团有限公司（中国山东）提供，纯度为95%，分子量分别为20,000?Da和30,000?Da[31]。这两种多糖的结构特征如图1A和B所示。肽底物MCA-AVLQSGFR-Lys(DNP)K-NH₂的纯度为98%，由南京肽科技有限公司（中国南京）合成。其他使用的化学物质和试剂均为HPLC级别的。

IJSPS抑制SARS-CoV-2的M^pro活性，而PSPS则没有

对于表达并纯化的M^pro蛋白酶，通过SDS–PAGE分析进行了验证。结果与我们的先前研究一致，显示其分子量约为35?kDa，这与基于其氨基酸序列计算出的34.436?kDa相符。

使用广泛使用的商业荧光共振能量转移（FRET）肽底物评估了M^pro的蛋白水解活性[13]。

结论

在这项研究中，我们系统地研究了两种硫酸化多糖IJSPS和PSPS对M^pro蛋白水解活性的影响。我们的结果表明，IJSPS对M^pro具有强抑制作用，而PSPS则没有可检测到的效果。此外，通过内在色氨酸荧光淬灭测定法检查了IJSPS、PSPS和M^pro之间的相互作用，发现这两种硫酸化多糖均能与M^pro发生可测量的结合。

CRediT作者贡献声明

Jinwen Li：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，软件使用，资源管理，方法学，实验设计，数据分析，概念化。Shu Jie Li：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，资源获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作部分得到了山东省自然科学基金（ZR2020MC056）的支持。