电子调控黄素依赖性单加氧酶水杨酸羟化酶（NahG）中黄素的还原和脱羰反应

《Bioorganic Chemistry》：Electronic modulation of flavin reduction and decarbonylation in the flavin-dependent monooxygenase salicylate hydroxylase (NahG)

水杨酸羟基酶NahG催化氧化脱羰基反应，通过C4a-羟基黄素阴离子中间体实现芳烃环羟基化并断裂C-S-C键生成邻苯二酚，羰基取代基电子效应显著影响催化效率和产物类型。

　　

阿拉丁·F·戈麦斯（Aladim F. Gomes）|卢卡斯·A·维埃拉（Lucas A. Vieira）|阿道夫·H·莫拉埃斯（Adolfo H. Moraes）|罗纳尔多·A·P·纳格尔（Ronaldo A.P. Nagem）|蒂亚戈·A·S·布兰当（Tiago A.S. Brand?o）

巴西米纳斯吉拉斯联邦大学（Universidade Federal de Minas Gerais）精确科学研究所（Instituto De Ciências Exatas）化学系，贝洛奥里藏特（Belo Horizonte），MG 31270-901

摘要

水杨酸盐羟化酶（NahG）是一种依赖于黄素的单加氧酶，它通过C4a-羟基过氧化黄素中间体介导的ipso-羟基化反应，催化水杨酸盐的氧化脱羧。本研究揭示了在水杨酸盐衍生物底物中，羰基取代基的变化（包括酰胺、羟胺酸、酯、醛和酮等结构）会调节催化效率和反应产物。除了甲基水杨酸盐外，所有底物在芳香羟基化后都会发生芳基-羰基C-C键的断裂，生成儿茶酚，这种脱羧反应性在依赖黄素的单加氧酶中是前所未有的。底物的结合能力与ortho酚基的质子化状态相关，而催化效率则显著依赖于羰基取代基的电子特性，表明共振供电子作用调节了还原半反应，并决定了氧气活化前的反应方向。这些发现表明，黄素的还原是一个受电子调控的关键步骤，而脱羧反应是NahG催化作用的内在特征。

引言

黄素蛋白单加氧酶（FPMOs）是一类结构多样、机制各异的氧化还原酶，它们通过还原型黄素辅因子（最常见的为黄素单核苷酸FMN或黄素腺嘌呤二核苷酸FAD）激活分子氧来催化氧化反应。其催化过程中的核心步骤是形成C4a-羟基过氧化黄素中间体，该中间体具有强氧化能力且可调节。数十年的机制和结构研究表明，这种中间体能够参与多种化学转化，如亲电芳香取代（S_EAr）、杂原子氧化、Baeyer-Villiger氧化以及自由基相关反应[1], [2], [3]。这些研究中的一个共同点是，C4a-羟基过氧化黄素的固有反应性可能受到与结合底物及活性位点环境的微妙相互作用的影响[1], [4], [5]。从机制角度来看，FPMOs成为研究酶如何控制高活性黄素-氧中间体的同时保持化学选择性氧转移的典范，这一特性对其生物技术应用至关重要[2], [3]。 近年来，人们越来越关注FPMOs的催化多样性，包括底物和产物的广泛适应性[3], [6], [7], [8]、辅因子的通用性[9], [10], [11], [12]以及反应机制的灵活性[1], [2], [3]。这种多样性有助于揭示氧转移、底物活化及键断裂的调控机制，因为底物和辅因子的电子性质变化可以改变同一反应中间体的命运[6], [10], [13]。尽管FPMOs能够进行氧转移反应，但人们对它们如何影响之前的还原半反应（尤其是黄素辅因子的还原过程）关注较少。 那些在保持共同氧化反应的同时能够调节单个取代基命运的FPMOs，为研究电子效应如何影响反应结果提供了极好的模型。水杨酸盐羟化酶（SalH，EC 1.14.13.1）就是这样的例子。在天然状态下，SalH是一种依赖FAD的单加氧酶，利用NADH和分子氧催化水杨酸盐的氧化脱羧。如图1所示，该反应通过ipso C-1位置的亲电芳香取代进行，羟基化由C4a-羟基过氧化黄素中间体介导，随后断裂羧基取代基与芳香环之间的碳-碳键，生成儿茶酚和二氧化碳。这种反应路径被称为耦合路径。而在非耦合路径中，C4a-羟基过氧化黄素中间体会无产地产生过氧化氢和氧化的FAD，底物不会发生转化[17], [18]。 尽管SalH遵循相同的芳香羟基化机制，但它并不局限于羧酸类底物。该酶还能催化水杨醛的脱羧反应，生成儿茶酚作为芳香产物，但产生的副产物是甲酸而非二氧化碳[19]。芳香羟基化的保守性与羰基命运的多样性表明，该酶能够适应ipso位置上不同的取代基，并通过相关但不同的反应途径引导它们。这种羰基命运的差异，尽管保持了芳香羟基化步骤，仍允许系统地评估取代基的电子性质如何影响催化效率和羰基片段的后续命运。 在本研究中，我们进一步探讨了来自Pseudomonas putida G7的水杨酸盐羟化酶NahG的催化多样性，该酶是连接萘降解两条途径的关键酶[20], [21]。通过分析一系列具有不同羰基结构的水杨酸盐衍生物，我们系统地研究了取代基的电子效应对催化过程的影响（见图2）。这些底物被设计用于系统改变羰基附近的共振供电子能力和电子吸引能力。通过关联动力学参数与取代基的电子性质、分析反应产物以及量化反应的解偶程度，我们评估了羰基变化如何影响还原半反应及后续催化循环的化学步骤。总体而言，这些结果扩展了已知的水杨酸盐羟化酶的底物范围，并提供了更深入的理解，揭示了黄素蛋白单加氧酶如何利用底物-辅因子之间的电子耦合来调控反应性和催化多样性。值得注意的是，除了之前报道过的水杨醛[19]外，此处描述的所有其他底物转化都是首次发现。

材料

黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD，二钠盐水合物，纯度>95%）和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，二钠盐，纯度>97%）购自Merck公司。水杨酰胺[22]和碳酸甲钠[23]按照文献方法合成。使用升华法纯化儿茶酚后使用。其他试剂均为分析级，使用前无需额外纯化。水溶液使用去离子水配制。

产物鉴定与反应转化率

反应产物通过¹H NMR光谱进行鉴定。底物（浓度500 μM）与过量的NADH（750或2250 μM）在pH 8.5的缓冲液中孵育16小时（室温约24°C），有或无NahG参与。采集数据前将样品稀释至10%（体积比）D₂O。除甲基水杨酸盐外，图2中显示的所有底物均发生了有效的芳香转化，生成儿茶酚为主要产物。表1总结了用于转化鉴定的¹H核磁共振化学位移。

底物多样性与脱羧反应

选择了一系列与水杨酸盐相关的底物，研究它们被水杨酸盐羟化酶NahG催化的情况。¹H NMR分析显示（见表1），除了甲基水杨酸盐（未观察到底物转化），所有其他底物均生成相同的芳香产物儿茶酚。然而，羰基衍生物的性质不同，其副产物的种类也有所不同。

结论

本研究证明，NahG能够处理结构多样的含有羰基取代基的水杨酸盐，同时保持共同的ipso-羟基化反应，生成儿茶酚作为芳香产物。羰基取代基的变化不仅影响催化效率，还影响羰基衍生物的性质，表明其脱羧能力超出了其本身的氧化脱羧功能。此外，还观察到了芳基-羰基C-C键的断裂现象。

CRediT作者贡献声明

阿拉丁·F·戈麦斯（Aladim F. Gomes）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、实验实施。 卢卡斯·A·维埃拉（Lucas A. Vieira）：方法学设计、实验实施。 阿道夫·H·莫拉埃斯（Adolfo H. Moraes）：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金申请。 罗纳尔多·A·P·纳格尔（Ronaldo A.P. Nagem）：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、实验实施、概念设计。 蒂亚戈·A·S·布兰当（Tiago A.S. Brand?o）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、实验监督、资源获取、方法学设计、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

感谢CNPq和FAPEMIG提供的财政支持，以及UFMG的LAREMAR和NEPS提供的实验设施。