灵芝微孢子菌的免疫调节蛋白通过氧化还原失衡和内质网应激诱导的细胞凋亡来抑制骨肉瘤的生长

《Bioorganic Chemistry》：Ganoderma Microsporum immunomodulatory protein suppresses osteosarcoma growth through redox imbalance and ER stress-driven apoptosis

GMI通过诱导ROS积累、ER应激、线粒体功能障碍和自噬调控选择性抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡，在裸鼠移植瘤模型中显示抗肿瘤活性。

　　

孙英瑞|张志珍|张宗明|陈鹏|刘菊芳

台北医学大学口腔医学院牙科技学院，台湾台北110301

摘要

骨肉瘤（OS）是一种侵袭性强的骨恶性肿瘤，治疗效果有限且存在持续的化疗耐药性，这突显了开发更安全、更有效治疗方法的必要性。灵芝微孢子免疫调节蛋白（GMI）是一种源自真菌的生物活性分子，具有抗肿瘤活性，但其对骨肉瘤的作用机制尚不清楚。本研究探讨了GMI在骨肉瘤中的抗癌潜力及其作用机制。GMI可选择性地降低HOS和U2OS细胞的活力，同时对正常成骨细胞的毒性较低。GMI可引起细胞形态改变、染色质浓缩、菌落形成减少、细胞凋亡以及细胞周期停滞在G2/M期。RNA测序发现292个上调基因和158个下调基因，表明GMI抑制了DNA修复、细胞增殖、细胞周期进展和线粒体相关通路，并激活了自噬相关信号通路。机制研究表明，GMI增加了细胞内的活性氧（ROS）水平，而N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以减轻GMI诱导的细胞凋亡并恢复细胞活力。GMI诱导的内质网（ER）应激与JNK激活有关，持续的JNK激活通过抑制抗凋亡蛋白BCL-2并增强促凋亡蛋白来破坏BCL-2家族蛋白的平衡，从而驱动骨肉瘤细胞的线粒体依赖性凋亡。此外，GMI处理还能促进酸性囊泡器官和类似自噬体的结构形成，同时增加LC3B-II水平并降低p62水平。使用Baf A1、CQ或3-MA阻断自噬可进一步增强GMI诱导的细胞凋亡并加剧细胞活力的下降。最后，在异种移植模型中，GMI显著抑制了肿瘤生长，且未影响体重。这些发现表明GMI是一种有前景的骨肉瘤天然治疗候选物，值得进一步进行临床前和转化研究。

引言

骨肉瘤（OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，其特征是局部侵袭性强且易发生肺转移。尽管采用了包括新辅助多药化疗、广泛手术切除和术后辅助治疗在内的多种治疗方法，但复发性或转移性骨肉瘤患者的总体生存率四十多年来几乎没有变化[1]。尽管高剂量甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂和异环磷酰胺仍是标准治疗手段，但化疗耐药性的产生和严重的系统毒性显著限制了其治疗效果[2],[3]。因此，迫切需要寻找具有更好安全性、肿瘤选择性和机制特异性的新型治疗药物，包括具有免疫调节或细胞毒性作用的天然来源药物。

骨肉瘤的发病机制和进展涉及多种细胞过程的异常相互作用，包括异常增殖、DNA损伤修复（DDR）缺陷、线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡和自噬。骨肉瘤表现出显著的基因组不稳定性，包括广泛的染色质变异和DDR通路改变，这些因素导致化疗耐药性和肿瘤异质性[4],[5]。研究表明，抑制DNA修复或细胞周期进展可提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性[6]。线粒体功能障碍和氧化还原失衡也是骨肉瘤生物学的关键因素：多个骨肉瘤预后模型指出线粒体代谢基因是肿瘤进展和治疗反应的关键调节因子[7],[8]。应激相关通路（如内质网（ER）应激和未折叠蛋白反应）进一步调节骨肉瘤细胞的存活，根据应激的严重程度和持续时间可能引发凋亡或适应性反应[9]。这些应激反应与线粒体功能、氧化还原平衡和细胞凋亡密切相关。此外，自噬在骨肉瘤中具有双重作用：过度自噬可能促进细胞死亡，而基础或诱导的自噬通常具有细胞保护作用并有助于化疗耐药性[10],[11]。综上所述，这些生物学弱点突显了能够干扰氧化稳态、线粒体完整性、内质网应激通路和自噬动态的药物的治疗潜力。

灵芝微孢子免疫调节蛋白（GMI）属于真菌免疫调节蛋白（FIP）家族。GMI作为一种具有抗癌潜力的天然生物活性分子备受关注。已有研究显示，GMI可通过诱导细胞凋亡或自噬、线粒体损伤、氧化应激和EGFR降解等机制抑制多种癌症类型的肿瘤生长[12],[13],[14]。GMI还能抑制癌细胞增殖，下调干细胞标记物表达，调节整合素信号通路，并通过下调PD-L1增强抗肿瘤免疫力[15],[16],[17]。此外，GMI与某些化疗药物具有协同细胞毒性[12]。尽管这些研究表明GMI具有多方面的抗癌机制，但目前尚无直接评估其在骨肉瘤中的治疗潜力或作用机制的研究，这是一个重要的知识空白。

鉴于迫切需要更安全、更有效的治疗策略，并考虑到氧化应激、内质网应激、线粒体损伤和自噬在骨肉瘤进展中的重要作用，研究GMI是否能够调节这些通路具有重要的科学和转化意义。因此，本研究旨在系统评估GMI对骨肉瘤细胞的抗肿瘤效果，评估其对正常成骨细胞的选择性，并阐明涉及的细胞应激反应和死亡途径，包括ROS积累、ER应激相关的Ca²⁺失调、线粒体膜去极化、caspase依赖性凋亡和自噬调节。通过填补这些知识空白，我们的工作旨在为GMI作为骨肉瘤天然治疗候选物的应用提供基础证据，并为未来的联合治疗策略或转化研究提供机制依据。

化学试剂

特异性针对Grp78（GTX113340）、Grp94（GTX103232）、ATF6（GTX104820）、PERK（GTX129275）、IRE1（GTX30005）、Calpain-1（GTX102340）、Calpain-2（GTX111809）、Bcl-2（GTX100064）、Bcl-xL（GTX637940）、Bax（GTX109683）、Bak（GTX100063）、LC3B（GTX00949）、p62（GTX636328）、切割的caspase-3（GTX03281）、切割的caspase-9（GTX86945）和GAPDH（GTX100118）的一抗购自GeneTex（美国加利福尼亚州尔湾）。特异性针对磷酸化JNK（#4668）和总JNK（#9252）的一抗也来自相应供应商

GMI选择性降低骨肉瘤细胞活力并改变细胞形态

为了评估GMI在骨肉瘤中的抗癌效果，将HOS、U2OS和正常成骨细胞（hFOB1.19）分别用不同浓度的GMI（0、1.25、2.5、5和10 μg/mL）处理24小时和48小时，随后进行CCK-8分析。2.5 μg/mL的GMI在24小时和48小时均显著降低了两种骨肉瘤细胞的活力，而正常成骨细胞仅在最高浓度（10 μg/mL）下表现出显著活力下降，表明GMI的作用更强

讨论

骨肉瘤（OS）仍然是青少年和年轻成人中最常见的原发性恶性骨肿瘤，其治疗进展多年来停滞不前。目前的治疗主要依赖于多药化疗结合手术切除，但复发性或转移性骨肉瘤患者的生存率仍然很低[1],[2]。主要挑战在于内在或获得的化疗耐药性，这与DNA修复通路紊乱、细胞周期失调密切相关

结论

GMI通过诱导ROS积累、内质网应激、线粒体功能障碍和caspase依赖性凋亡来选择性抑制骨肉瘤生长。同时，GMI还能触发保护性自噬，阻断这一过程可增强其细胞毒性。这些发现表明GMI是一种有前景的骨肉瘤治疗候选物。

科学写作中关于生成式AI的声明

在准备本论文期间，作者使用了Grammarly（https://www.grammarly.com/）来提高稿件的清晰度和语言质量。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

作者贡献声明

孙英瑞：撰写——初稿、方法学设计、实验实施、资金获取、数据分析、概念构思。张志珍：方法学设计、实验实施、资金获取、数据分析、概念构思。张宗明：结果验证、数据分析、数据管理。陈鹏：结果验证、实验实施、数据管理。刘菊芳：撰写——审稿与编辑、项目监督、实验实施、资金获取、数据管理。

患者同意书

不适用。

伦理批准和参与同意

所有动物实验均获得了新光吴胡纪念医院机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号115SKH003），并遵循机构和国家的实验室动物护理和使用指南进行。

资金来源

本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC113–2628-B-038 -008 -MY3）（NSTC112–2221-E-038-006-MY3）和（NSTC112–2811-E-038-004-MY3）的资助，以及台北医学大学（DP3–114–62,322-04；114-TMU-NTUST-114-08）和新光吴胡纪念医院（2025SKHADR013）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。

致谢

我们感谢MycoMagic Biotechnology有限公司提供GMI样本。