《Chemico-Biological Interactions》：Exogenous pyruvate restores mitochondrial bioenergetics by synergizing with the AMPK-mTOR-SIRT3 pathway to alleviate sepsis-associated acute kidney injury
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SA-AKI缓解机制及AMPK-mTOR-SIRT3通路研究。摘要显示乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化、NAD+水平及线粒体动态平衡在治疗中起关键作用。
王国跃|王文文|孙健|周树生|倪丽君|董梦珍|王欣|袁园|王杰|任鹏飞|方文香|金奎
中国科学技术大学第一附属医院急诊医学系，生命科学与医学部，合肥230001，中国
摘要
脓毒症相关性急性肾损伤（SA-AKI）与严重的代谢重编程和线粒体功能障碍密切相关，然而有效的代谢靶向疗法仍然有限。在本研究中，我们阐明了外源性代谢底物乙基丙酮酸（EP）通过AMPK-mTOR-SIRT3信号通路调节线粒体生物能量代谢来缓解SA-AKI的分子机制。利用盲肠结扎和穿刺诱导的SA-AKI小鼠模型以及LPS刺激的HK-2细胞，我们证明了EP与AMPK激活剂AICAR联合使用可以显著改善肾功能，减少损伤标志物和炎症，并提高生存率。单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，在脓毒症期间肾上皮细胞中发生了广泛的代谢重编程，其特征是线粒体功能障碍和氧化磷酸化（OXPHOS）受到抑制。从机制上讲，EP和AICAR联合治疗比单独使用EP更能通过恢复NAD+/NADH平衡、增加线粒体DNA（mtDNA）含量、改善线粒体呼吸链复合体活性以及重新平衡线粒体分裂-融合动态来缓解线粒体功能障碍。EP和AICAR联合治疗还增强了自噬作用并减少了凋亡，部分机制依赖于AMPK-mTOR信号通路下游的SIRT3。这种效应可以通过预先使用雷帕霉素（Rapa）或干扰素-γ（IFN-γ）来增强或减弱。SIRT3的药理抑制部分消除了EP的线粒体和细胞保护作用，证实SIRT3是AMPK-mTOR信号通路的关键下游效应因子。总体而言，我们的数据表明EP作为一种代谢调节剂，与AMPK激活联合使用可以缓解SA-AKI。这种效应是通过AMPK-mTOR-SIRT3信号通路恢复线粒体功能和OXPHOS来实现的，为SA-AKI的代谢导向治疗策略提供了机制基础。
引言
脓毒症相关性急性肾损伤（SA-AKI）是脓毒症中常见且危及生命的并发症，发病率在45%到70%之间[1]，[2]。这种情况与更高的28天死亡率密切相关[3]。尽管抗菌治疗和器官支持护理取得了进展，但SA-AKI相关的死亡率仍然很高，凸显了当前抗炎疗法的局限性[4]。越来越多的证据表明，SA-AKI不仅仅是血流动力学不稳定或免疫失调的结果，还与细胞能量代谢的严重紊乱密切相关，特别是肾小管上皮细胞中的线粒体功能障碍[5]，[6]。
鉴于肾小管细胞的巨大代谢需求，线粒体对于维持能量稳态至关重要[7]。在脓毒症期间，线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）明显受损，伴随ATP生成减少、线粒体动态紊乱和氧化应激增加[8]。这些代谢异常导致适应性自噬和凋亡之间的失衡，最终导致肾小管损伤和肾功能障碍[9]。最近的研究将代谢重编程视为脓毒症诱导的器官损伤的关键因素，特别关注线粒体质量控制和能量保存作为SA-AKI干预的潜在治疗靶点[10]，[11]。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一种重要的细胞能量传感器，参与维持线粒体稳态和调节整体能量代谢，从而直接影响SA-AKI的进展[12]，[13]。一旦被激活，AMPK主要通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）信号通路来调控线粒体动态，这有助于改善线粒体功能、增强肾小管细胞存活率，从而缓解SA-AKI[14]，[15]。Sirtuin 3（SIRT3）是一种依赖NAD+的线粒体去乙酰化酶，最近被确定为SA-AKI中保护肾脏的有力候选分子[13]。SIRT3的激活可以脱乙酰化关键底物，从而缓解线粒体功能障碍和细胞凋亡，最终改善SA-AKI的病理进程[16]，[17]。我们之前的研究发现，在SA-AKI早期激活AMPK可以上调线粒体SIRT3的表达，从而增强代谢适应性（包括线粒体修复和能量稳态）并减少肾细胞损伤[12]。然而，外源性丙酮酸干预在SA-AKI期间调节AMPK-mTOR-SIRT3通路的机制尚未完全明了。
丙酮酸是糖酵解的关键产物，是三羧酸（TCA）循环的重要底物[18]。乙基丙酮酸（EP）是丙酮酸的简单衍生物，通过调节代谢和炎症通路发挥多种作用，以防止脓毒症引起的器官损伤[19]。一些研究表明，EP剂量依赖性地抑制NOD样受体家族pyrin结构域包含3（NLRP3）炎性小体的激活，并优化线粒体能量代谢[20]，[21]，这对细胞代谢重编程至关重要。此外，EP还能减少高迁移率族盒1（HMGB1）的细胞外释放，并减轻氧化应激相关的组织损伤[22]，[23]，从而在脓毒症期间增强器官功能。除了这些免疫调节作用外，EP还作为外部代谢底物，恢复TCA循环中间产物并影响细胞内NAD+/NADH比例[24]，[25]。然而，EP通过其对线粒体生物能量代谢和代谢重编程的影响来缓解SA-AKI的具体机制尚未完全明确。
在本研究中，我们假设EP作为一种代谢调节剂，通过建立有利于AMPK信号激活的生物能量环境来发挥作用。通过激活AMPK-mTOR-SIRT3信号通路，EP可能有助于促进SA-AKI期间肾脏组织的线粒体恢复和代谢重塑。这里的研究结果为EP在代谢补充与AMPK激活结合使用，以防止脓毒症引起的肾损伤方面提供了新的视角，从而提出了以代谢为中心的SA-AKI治疗策略。
试剂和抗体
脂多糖（LPS，大肠杆菌O55:B5）、寡霉素、FCCP、罗丹明（Rot）和抗霉素A（AA）购自Sigma-Aldrich（美国）。乙基丙酮酸（EP）、AICAR、雷帕霉素（Rapa）和3-TYP购自Med Chem Express（美国）。针对以下蛋白质的抗体来自Abcam（美国）：AMPK、SIRT3、mTOR和磷酸化mTOR（p-mTOR）。抗p-AMPK、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、p-ACC、4E结合蛋白1（4E-BP1）、p-4E-BP1、S6激酶1的抗体
EP和AICAR联合使用可缓解SA-AKI中的肾损伤并提高生存率
我们之前的研究表明，在CLP诱导的SA-AKI模型中，术后6小时肾AMPK磷酸化（p-AMPK/AMPK比率）显著增加，但在脓毒症引起的器官损伤高峰期（CLP后24小时）显著下降[12]。这表明AMPK信号通路在SA-AKI早期进展过程中最初被激活作为补偿反应。为了研究AMPK活性与肾损伤进展之间的相关性，我们监测了肾功能
讨论
本研究阐明了一种新的治疗策略，即EP作为一种代谢底物，通过与AMPK-mTOR-SIRT3信号通路结合促进保护性代谢重编程来缓解SA-AKI。如图7所示，实验数据表明，EP特别是与AMPK激活剂AICAR联合使用，在小鼠和细胞模型中表现出显著的肾保护作用。ScRNA-seq分析显示严重的线粒体损伤和明显的OXPHOS障碍
结论
总之，我们的发现表明，EP通过作为代谢调节剂支持线粒体能量代谢来缓解SA-AKI。通过增强AICAR诱导的NAD+升高和AMPK-mTOR-SIRT3通路的激活，EP有助于维持线粒体功能、保护氧化磷酸化并促进肾小管细胞存活。总体而言，这些结果为SA-AKI的代谢基础提供了新的见解，并为开发治疗策略提供了理论依据
作者贡献声明
金奎：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，监督，资金获取。王国跃：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，方法学研究，数据管理。方文香：数据可视化，监督。金奎：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，监督，资金获取。任鹏飞：软件支持。王杰：软件支持，方法学研究。袁园：方法学研究。王欣：方法学研究。倪丽君：
伦理批准和参与同意
所有动物实验均在华东科技大学第一附属医院的动物实验中心进行，并获得了该医院的机构动物护理和使用委员会的批准（伦理批准编号2024-N(A)-0186）。
出版同意
所有作者都对本文做出了实质性贡献，并同意发表。
数据获取
支持本研究结果的数据可应要求向通讯作者索取。关于手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本论文的过程中，作者使用了DeepSeek AI来协助语言编辑和润色。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。资助
本研究得到了安徽省自然科学基金（编号2208085MH235）的支持。利益冲突声明
? 作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。致谢
本研究是独立完成的，没有特定的个人或组织需要致谢。
