《Aquaculture》：Establishment and identification of an embryonic cell line of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) and its application in germplasm conservation and disease resistance
编辑推荐：
中国鲟胚胎细胞系ASE48h的建立及功能分析。通过48小时神经胚期胚胎获得首例中国鲟胚胎细胞系，优化培养条件至80代，染色体分析显示190-276条，以220-270条为主。验证细胞具备转染能力及碱性磷酸酶染色显示20%多干细胞特性。通过LPS和Poly(I:C)刺激，转录组分析发现细菌和病毒刺激下分别上调2210和1095个差异基因，涉及炎症因子、干扰素通路及细胞外基质相互作用等。该细胞系为研究中国鲟功能性响应机制提供重要工具。
张琪|刘娟娟|龚志红|李文杰|郭晨飞|梅佳琪|孙宇琦|陈松林|王娜
中国水产科学院黄海渔业研究所海洋养殖生物育种与可持续产品国家重点实验室，山东省青岛市266071
摘要 中华鲟（Acipenser sinensis ）是中国一级保护野生动物，被誉为“水中的大熊猫”。目前，关于中华鲟的研究主要集中在形态学和生殖生物学方面，而细胞生物学方面的研究相对较少。本研究建立了首个来自48小时神经胚阶段的中华鲟胚胎细胞系（ASE48h）。该细胞系已成功传代至第80代。ASE48h细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的L-15培养基中于24°C条件下培养。经过冷冻保存和复苏后，约80%的细胞恢复了正常生长。在含有20% FBS的培养基中，细胞增殖率达到最大值，细胞倍增时间为87.34小时。染色体分析显示其染色体数目在190至276之间，其中69%的细胞含有220–270条染色体。使用Lipo8000转染试剂，这些细胞能够成功接受cy3-siRNA的转染。此外，还通过脂多糖（LPS）和Poly（I:C）分别研究了细胞对细菌和病毒刺激的免疫反应。后续的转录组分析表明，LPS刺激引发了2210个差异表达基因，这些基因主要涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路和NF-kappa B信号通路等；而Poly（I:C）处理则诱导了1095个差异表达基因，涉及细胞外基质-受体相互作用、焦点黏附和人乳头瘤病毒感染等。碱性磷酸酶（AP）染色显示约20%的ASE48h细胞具有多能性。通过对包括id1 、myc 、nes 和wdr43 等基因的功能富集分析（FPKM >50），确认该细胞系主要由神经干细胞/前体细胞组成。ASE48h细胞系的建立为研究中华鲟的功能响应机制提供了宝贵的工具，而无需消耗这种濒危物种的个体。
引言 中华鲟（Acipenser sinensis ）属于鲟形目（Acipenseriformes）、鲟科（Acipenseridae）和鲟属（Acipenser），其进化速度比其他脊椎动物慢，被视为活化石（Bemis等人，1997年；Zhang等人，2022年）。它是全球最大的鲟鱼物种，分布纬度范围最窄。由于水坝建设、过度捕捞、水污染和航运活动，中华鲟的自然种群数量急剧下降，自2013年以来长江再未记录到其产卵行为，该物种在野外面临严重的灭绝风险（Liao等人，2023年；Wang等人，2011年；Wu等人，2015年）。2009年，国际自然保护联盟（IUCN）红色名录将其列为极危物种（CR），这表明其生存面临极高的风险。
随着种群数量的急剧减少，仅依靠传统的野外保护措施（如人工繁殖）来实现种群的快速稳定和恢复变得越来越困难。此外，中华鲟性成熟所需的时间较长，也阻碍了人工繁殖的努力。因此，开发离体保护技术（如细胞水平保护）至关重要。
自Wolf在1962年成功建立世界上第一个鱼类细胞系——虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss ）的生殖细胞系RTG-2以来，鱼类细胞系技术迅速发展，现已广泛应用于鱼类生物学研究的各个领域，为濒危鱼类的保护和研究奠定了重要的技术基础（Fryer等人，1965年；Wolf和Quimby，1962年）。
根据最全面的细胞系数据库Cellosaurus（
https://web.expasy.org/cellosaurus/ ），截至2025年4月，全球已成功建立了996个鱼类细胞系。其中56个细胞系来自鲟鱼物种，包括西伯利亚鲟（
Acipenser baerii ）的生殖腺和头肾细胞系，以及大西洋鲟（
Acipenser oxyrinchus ）的幼体和心脏细胞系（Grunow等人，2021年；Li等人，1985年；Ryu等人，2016年）。值得注意的是，目前仅有一个关于中华鲟的细胞系报道——即从尾鳍衍生出的CSTF细胞系（Zhou等人，2008年）。虽然现有的尾鳍细胞系对于研究成体组织生理或遗传学非常宝贵，但不足以用于物种恢复研究。因此，建立来自胚胎的细胞系对于本研究至关重要。
胚胎干细胞（ESCs）具有在体内分化为所有脊椎动物细胞类型的潜力，使其成为发育生物学和再生医学的重要工具（Evans和Kaufman，1981年；Takahashi和Yamanaka，2006年）。在体外培养条件下，ESCs不仅能够无限自我更新，还能通过表达多能性转录因子和关键调控基因保持未分化状态，同时保留分化为多种细胞谱系的能力（Christophersen和Helin，2010年）。由于关于鲟鱼胚胎干细胞的研究仍然有限，目前仅有一项关于长江鲟（Acipenser dabryanus ）胚胎细胞系（ADEc）建立的研究报道（Gong等人，2023年），因此在本研究中建立和应用鲟鱼胚胎干细胞系是一个尚未充分探索的研究领域。
48小时胚胎是多能细胞的丰富来源，这些细胞非常适合体外培养条件。此外，48小时胚胎阶段还具有高细胞产率和显著的发育可塑性。因此，本研究成功建立了首个来自中华鲟的胚胎细胞系（ASE 48h），系统优化了其培养条件，并进行了核型分析。
主要的细菌病原体，如Aeromonas hydrophila （Zhou等人，2018年）和Streptococcus inia （Pierezan等人，2020年），以及病毒病原体如欧洲鲟虹彩病毒（Mugetti等人，2020年）和鲟鱼核质大DNA病毒（Ciulli等人，2016年），对鲟鱼养殖构成了重大挑战。为了评估该细胞系的免疫反应能力，我们分别用LPS和Poly(I:C)刺激ASE 48h细胞，以模拟细菌和病毒感染。炎症因子和干扰素的显著上调证实了ASE 48h细胞保留了功能性先天免疫通路。此外，我们还评估了其转染效率和多能性，以探索其作为中华鲟功能基因组学和物种恢复研究的体外模型的潜力。
动物伦理 本研究遵循了美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南和规定，并得到了中国鲟鱼研究所（湖北省宜昌市）生物伦理和生物安全委员会的批准。
原代细胞培养和传代
收集了受精后48小时的中华鲟（A. sinensis ）神经胚。将胚胎用PBS冲洗3-4次以去除残留的卵黄，然后重新悬浮在PBS中。
ASE48h细胞系的建立 收集了48小时大的中华鲟胚胎（图1A），并将其接种到25平方厘米的培养瓶中。经过4-5天的培养后，可以看到大量迁移的细胞在原代培养物周围生长，表现出紧密的细胞间接触和多样的形态特征（图1B）。到第15天时，细胞在培养瓶中的密度达到约80%。随后3-4天的持续监测显示细胞生长停止。
讨论 建立中华鲟胚胎细胞系面临的主要挑战是分离胚胎体与卵黄囊。传统的组织移植培养方法对鲟鱼胚胎的效果有限，这可能是由于卵黄中的物质抑制了细胞迁移。酶消化可以去除阻碍细胞生长的细胞外基质（包括颗粒物质和纤维），从而有助于细胞分离。
CRediT作者贡献声明 张琪： 撰写——初稿，验证。刘娟娟： 撰写——审稿与编辑，监督，资源提供。龚志红： 可视化，方法学，数据管理。李文杰： 撰写——审稿与编辑。郭晨飞： 可视化，验证。梅佳琪： 验证。孙宇琦： 方法学，数据管理。陈松林： 资源提供，资金获取。王娜： 撰写——审稿与编辑，项目管理，正式分析。
未引用的参考文献 Bi等人，2019
Fontana等人，1997
Hu等人，2020
Park等人，2022
Ryu等人，2018
Zhuang等人，2002
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了湖北省中央政府指导的地方科技发展专项资金（2024CSA072-->）、山东省泰山青年学者项目（tsqn202211266-->）、山东省重点研发计划（针对山东省院士团队，2023ZLYS02-->）以及中央公益性科研机构基础研究基金（CAFSC）（2023TD20-->）的支持。
