《Behavioural Processes》：Overt physiological responses and atypical behavior evoked in adult zebrafish in the novel tank test by two acute ‘survival’ stressors
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斑马鱼在新型鱼缸测试中因生存压力（如捕食者暴露和水流湍流）出现异常上层偏好，伴随皮质醇水平升高和原癌基因表达，表明其行为反应复杂，不能仅归因于焦虑。
宋云哲|崔家豪|蔡慧玲|张云倩|秦宇欣|周照文|冯浩宇|何淑蕾|何凯|刘玉成|王继义|江家友|李瑞宇|谢学松|周梅彤|索菲亚·蒙蒂|马里奥·德·拉·克鲁兹|杨龙根|王英泽|白玉飞|艾伦·V·卡卢埃夫
中国苏州西安交通大学利物浦学院理学院生物科学与生物信息学系
摘要
斑马鱼（Danio rerio）在神经行为学研究中的应用日益广泛。目前，新型“潜水”测试是评估成年斑马鱼行为最常用且最敏感的方法。在该测试中，鱼停留在底部通常被解释为与压力相关的恐惧/焦虑状态，而游到顶部则被视为具有抗焦虑作用的行为。然而，越来越多的证据表明斑马鱼在这种情境下的行为反应更为复杂。本研究报道了在两种极端生存压力（活体捕食者威胁和水动力湍流）作用下，斑马鱼表现出“非典型”的向顶部游动的偏好，同时伴有全身皮质醇水平升高以及早期原癌基因在大脑中的表达增强。这些现象表明，斑马鱼在新型测试中的行为表现受到多种因素的影响，而不仅仅是单纯的焦虑。因此，需要进一步系统地分析这些实验中的干扰因素，以确保对实验结果的准确解读。
引言
由于斑马鱼在生理和基因上与人类高度相似（Howe等人，2013年），具有保守的神经解剖结构和神经递质系统，以及可被充分研究的行为特征和高通量研究潜力（Kalueff等人，2014年；de Abreu等人，2020a年；Stewart等人，2015年；Meshalkina等人，2017年），它们被广泛用于研究大脑功能。虽然斑马鱼的行为通常通过标准化测试进行评估（Kysil等人，2017年；Ogi等人，2020年；Dos Santos等人，2021年；Haigis等人，2022年），但其反应也会受到生态环境的影响。例如，在面临捕食者威胁和觅食等竞争压力时，斑马鱼会在空间导航上做出动态权衡——它们不会简单地选择“战斗”或“逃跑”，而是根据环境线索（视觉、化学和水动力信号）进行复杂决策（Samaras和Pavlidis，2020年）。
新型测试是评估成年斑马鱼行为最常用的方法（Golushko等人，2025年），该方法基于鱼在容器中的垂直（顶部/底部）活动（Hillman等人，2024年；Dos Santos等人，2020年；Blaser和Rosemberg，2012年；Johnson等人，2024年；Muralidharan等人，2024年）。传统上认为鱼停留在底部反映了焦虑状态，但游到较为恶劣的“顶部”区域则与较低的焦虑水平相关（Cachat等人，2010年）。然而，这种对测试行为的解释可能过于简化，最近有研究提出需要重新思考这一概念，因为许多其他因素（如大胆/害羞、基地行为、刻板行为、回避行为、警觉性、觅食行为、领地性和社会性）也可能影响斑马鱼的行为（参见Golushko等人，2025年的综述）。例如，在这种测试以及其他基于新奇环境的测试中，游泳速度和与焦虑相关的静止状态（冻结）并不总是一致地反映焦虑反应（Johnson等人，2023年）。在经过改造的新型测试中，无论是具有焦虑诱导作用的化合物还是抗焦虑化合物都会增加鱼停留在底部的行为，这表明测试环境的改变显著影响了斑马鱼的反应（Johnson、Hurd和Hamilton，2024年）。此外，社交隔离的鱼表现出更高的压力水平（表现为皮质醇升高），但更倾向于待在容器的上部（Keenleyside，2012年；de Abreu等人，2020b年）；也有研究讨论了在这些鱼中，传统的焦虑行为指标与生理压力标志物之间的关联性可能因情境而异（Maximino等人，2010年）。
为了进一步探讨斑马鱼在新型测试中的空间偏好与其压力水平之间的分离关系，我们研究了鱼在暴露于两种极端生存压力（急性捕食者威胁和水动力湍流）后的行为变化。与传统基于焦虑的解释相反，这两种压力都导致了鱼向顶部的偏移，同时伴随着生理压力的升高（全身皮质醇水平升高和早期原癌基因在大脑中的表达增强）。这表明，在斑马鱼神经表型研究中，需要更细致地、具体情境地使用基于新奇环境的测试方法（Golushko等人，2025年），而不能仅根据鱼在容器中的位置将其行为简单地归类为“抗焦虑”或“促焦虑”。
实验部分
动物与饲养条件
实验使用了60条野生型短鳍斑马鱼（5-7个月大，雄雌比例约为1:1），这些鱼来自上海银诺水族科技有限公司（中国上海）。通过视觉检查和/或随机采集的鱼类的生殖腺解剖来定期监测鱼群的性别构成。实验前，所有鱼都接受了健康状况的筛查（如鳍部损伤、浮力不平衡等），并在斑马鱼核心设施中饲养至少3周。
结果
暴露于捕食者的斑马鱼在垂直活动能力和冻结行为上表现出显著变化（图1）：与对照组相比，它们进入顶部的次数较少（1.53 ± 0.74次 vs 11.40 ± 10.18次，p < 0.05，U = 49，df = 14.15，Cohen's d = 1.37），但在顶部的停留时间明显更长（240.1 ± 105.8秒 vs 73.93 ± 69.80秒，p < 0.001，U = 26.5，df = 28，Cohen's d = 1.85）。暴露于捕食者的鱼与对照组在冻结频率上也存在显著差异。
讨论
本研究首次量化了斑马鱼在新型测试中面对两种重大生存威胁（急性同域捕食者威胁和水动力湍流）后的生理反应和异常行为。我们发现，尽管斑马鱼在这些压力下表现出正常的生理应激反应（皮质醇升高和早期原癌基因在大脑中的表达增强），但其垂直游动行为却与传统解释相矛盾。
CRediT作者贡献声明
马里奥·德·拉·克鲁兹：研究工作、数据整理。周照文：撰写、审稿与编辑、研究工作。索菲亚·蒙蒂：研究工作、数据整理。秦宇欣：撰写、初稿撰写、研究工作。何淑蕾：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据整理。杨龙根：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据整理。冯浩宇：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据整理。
写作过程中是否使用了生成式AI和AI辅助技术
本手稿的撰写过程中未使用任何生成式AI技术。
致谢
本研究得到了SURF 2025计划的支持。资助方未参与研究的设计、分析、结果解读或发表决策。
