通过人类BK通道中的细胞色素c样结构域进行的血红素信号传导

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Heme signaling through the cytochrome c-like domain of the human BK channel

血红素通过Cytcl域的612CKACH616和Met691残基与人类BK通道结合，引发通道构象变化及功能抑制，突变体验证了Met691在heme信号传导中的关键作用。

　　

Fidan Gudratova|Nicoletta Savalli|Aysel Aliyeva|Taleh Yusifov

阿塞拜疆共和国科学与教育部分子生物学研究所，AZ1141，巴库，Z.Khalilov街117号

摘要

大电导电压激活和Ca²⁺激活的钾通道（BK通道）是细胞兴奋性的关键调节因子，并受到包括血红素在内的多种信号分子的调控。然而，关于血红素与BK通道结合的直接证据有限，血红素依赖性信号传导的机制仍不甚明了。人类BK通道门控环（GR）装置内的类细胞色素c（Cytcl）结构域被认为介导血红素信号传导。除了血红素感应基序^{612CKACH616外，残基Met691也可能有助于Cytcl结构域识别血红素，但其作为血红素感应残基的确切作用尚不清楚。}

吸收光谱分析显示，与野生型相比，C615S/H616R和M691A突变体的Soret信号在410 nm处显著减弱，而525/560 nm处的特征β/α带峰在突变蛋白中消失。

我们发现BK通道的GR能够以高亲和力（Kd ≈ 125 nM）结合血红素并发生构象变化。相比之下，Met691A突变体对血红素的敏感性显著降低，其Kd值约为841 nM。在非洲爪蟾卵母细胞中表达的野生型和Met691A通道的细胞内膜片钳记录显示，Met691A突变消除了血红素对BK通道活性的抑制作用。

本研究表明，血红素作为人类BK通道GR机制的天然配体，通过Cytcl结构域内的^{612CKACH616和Met691残基进行协调。血红素与Cytcl结构域之间的相互作用会导致GR内部发生显著的结构转变，这可能代表了人类BK通道的血红素介导的信号传导机制。}

引言

现代研究表明，血红素对生物体至关重要，是多种生理过程的新调控因子[1]、[2]、[3]、[4]。除了作为蛋白质辅因子外，血红素还作为一种多功能的信号分子，动态调节包括离子通道在内的多种蛋白质的活性。血红素在离子通道调节中起什么作用？这对生理过程有何重要性？

迄今为止，已经鉴定出许多对血红素敏感的离子通道，它们的活性受血红素调控[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。尽管这些离子通道中对血红素敏感的区域没有共同特征，但在不同通道中可以观察到一些相似的作用机制。在所有这些通道中，血红素都与细胞质结构域相互作用，通过结合蛋白质结构中的柔性区域来调节通道活性。

具体来说，在高电导钙（Ca²⁺）和电压激活（K⁺）通道（MaxiK；BK）中，血红素感应区域位于RCK1和RCK2结构域之间的构象灵活区域[13]、[14]、[15]、[16]。BK通道在调节血流、肾脏排泄、肌肉收缩、昼夜节律、听觉和癌症进展等方面起着关键作用，是最早被描述为具有血红素依赖性调节的通道之一[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。生物信息学和生化方法的数据表明，BK通道RCK1和RCK2结构域之间的血红素感应区域^{600SDA…TV715–665SDA…TV837包含与细胞色素c家族相似的结构元素[22]。该区域在血红素存在下可以折叠成紧凑的构象，形成类似细胞色素c的结构。这一区域包含}

^{612CKACH616–677CKACH681》，这是细胞色素c家族蛋白质中保守的血红素调控基序（HRM）。此外，细胞色素c中的Met80（血红素铁轴的第二个配体）与BK通道中的Met691-[M756]相同，表明Met691在血红素结合位点中起作用。该基序的突变会干扰血红素对通道的电生理作用，表明Met691-[M756]在BK通道的血红素感应中的作用尚不明确。目前缺乏血红素与BK通道结合的直接证据。为填补这一空白，我们使用生理相关的野生型和突变蛋白样本研究了BK通道的血红素结合特性。我们应用时间分辨的色氨酸荧光技术探讨了Met691-[M756]依赖的血红素诱导的构象变化。通过比较在非洲爪蟾卵母细胞中表达的WT和Met691-[M756]突变体通道，研究了Met691-[M756]在血红素依赖性调节BK通道活性中的作用。这种方法旨在阐明BK通道的配体结合特性。我们的发现表明，血红素是纯化的人类BK通道的天然配体，通过与612CKACH616677CKACH681残基的协同作用来发挥作用。}

章节片段

质粒构建和突变

cDNA人类BK通道C末端结构域(³²²IIE···ALK^{1005)（NCBI蛋白质数据库访问号#GI:507922），或[387IIE···ALK1070]（UniProt中的NP_002238.2/Isoform 5：Q12791·KCMA1_HUMAN，此编号将在括号中注明）通过聚合酶链反应（PCR）使用特定引物进行扩增。为确保其正确插入载体的多个克隆位点，正向引物包含一个BamHI限制性酶切位点，而反向引物包含一个HindIII}

从可溶性组分中表达和纯化人类BK通道C末端蛋白

BK通道的细胞内C末端（684个氨基酸）占整个通道的60%以上，包括两个配体感应模块RCK1和RCK2（图1），从可溶性组分中表达并纯化。我们还使用尿素溶解并在8 M尿素存在下重新折叠来纯化包含体的C末端蛋白，如先前所述[16]。

BK通道门控环内的类细胞色素c结构：Met691作为血红素铁的第二个轴向配体

血红素作为关键的辅因子和多功能生物调节剂，积极调节多种蛋白质功能和细胞通路[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。值得注意的是，它调节离子通道活性，影响氧气感知和通过神经信号传导调节血压等关键生理过程。尽管血红素作为离子通道调节剂的作用非常重要，但其作用机制仍大部分未得到解决。尽管直接证据表明血红素与离子通道的结合

CRediT作者贡献声明

Fidan Gudratova：撰写 – 原稿撰写，形式分析，数据管理。Nicoletta Savalli：形式分析，数据管理。Aysel Aliyeva：可视化，数据管理。Taleh Yusifov：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，数据管理，概念化。

资金来源

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

未引用的参考文献

[31]

利益冲突声明

特此声明，我们目前没有可能

i)?严重损害个人在联合委员会履行职责时的客观性，或

ii)?为任何个人或组织创造不公平的优势。作为联合委员会的成员或观察员，我将不会披露在联合委员会会议或其他场合获得的任何机密或专有信息

致谢

作者们想感谢Olcese Riccardo博士在研究本手稿方面提供的卓越支持。我们还要感谢Olsese实验室的前成员Antonios Pantazis博士和Roshni Madhvani博士。