新型烷基胺类Cbl-b抑制剂的发现、生物学评估及分子建模

《Bioorganic Chemistry》：Discovery, biological evaluation, and molecular modeling of novel alkylamine-based Cbl-b inhibitors

Cbl-b抑制剂通过三阶段优化（构象限制、疏水腔填充、SeeSAR骨架跳跃）开发新型烷基胺抑制剂，化合物27通过氢键和水桥与Tyr363结合，突破传统疏水堆积模式。

　　

Jinyu Tu|Yi Guan|Xi Gu|Yan Wang|Haiwei Shen|Ruirui Yang|Li Zhang|Xingyong Liu|Jingyi Zhou|Zhili Zuo

四川科技学院化学工程学院，中国自贡643000

摘要

Cbl-b是一种E3泛素连接酶，是T细胞激活的关键负调控因子，也是癌症免疫治疗的理想靶点。目前的小分子抑制剂主要依赖于与关键残基Tyr363的疏水性π–π堆叠相互作用，这限制了Cbl-b抑制剂的结构多样性，阻碍了新型支架抑制剂的发现。本研究报道了对环状氨基甲酸酯类先导化合物5的逐步优化过程，最终发现了几种新型的、具有代表性的基于烷胺的Cbl-b抑制剂。我们的优化过程包括三个阶段：（1）通过内酰胺化实现构象限制，得到了初始候选化合物12（IC₅₀ = 31.99 ± 3.88 μM）；（2）填充疏水空腔，得到了改进的类似物22（IC₅₀ = 8.58 ± 0.25 μM）；（3）利用SeeSAR指导的支架跳跃，最终确定了代表性的先导化合物27（IC₅₀ = 6.83 ± 0.51 μM）。分子对接和分子动力学（MD）模拟证实27能够结合到TKB-LH界面并稳定Cbl-b的非活性构象。值得注意的是，MD模拟显示27通过与Tyr363的独特极性相互作用（主要由氢键和水桥主导）来发挥抑制作用，这与传统的疏水性堆叠机制不同。这种新型的烷胺支架为开发结构多样的Cbl-b抑制剂提供了新的方法。

引言

针对PD-1/PD-L1和CTLA-4通路的免疫检查点阻断剂（ICBs）在过去十年中重新定义了肿瘤学领域[1]。通过恢复耗竭T细胞的效应功能以对抗肿瘤微环境中的抑制信号，ICB疗法有效改变了黑色素瘤和非小细胞肺癌（NSCLC）的临床治疗范式[2]。然而，ICB单药治疗的疗效仅限于20–30%的特定患者群体，大多数病例表现出内在或获得性耐药性，这是广泛临床应用的主要障碍[3]。为应对这些限制，药物研发工作正逐渐转向细胞内分子靶点，将免疫肿瘤学研究的范围从表面受体扩展到新的细胞内检查点[4]。在这种情况下，Casitas B谱系淋巴瘤（Cbl）蛋白家族——尤其是Cbl-b——作为T细胞激活的重要“刹车”机制。随着PD-1/CTLA-4阻断的临床成功，Cbl-b已成为癌症免疫治疗的下一代有希望的靶点[5]。

Cbl-b属于E3泛素连接酶家族，该家族还包括人类中的c-Cbl和Cbl-c[6]。与主要在造血干细胞中表达的c-Cbl不同，Cbl-b在成熟的外周T细胞和B细胞中高度表达，在维持外周免疫耐受中起着关键作用[7]。从结构上看，Cbl-b由几个功能域组成：酪氨酸激酶结合（TKB）域、连接螺旋（LH）区、RING指域，以及富含脯氨酸的区域（PRR）和泛素相关（UBA）域[8]。

Cbl-b的催化活性受复杂的构象动态调控。在其静息状态下，LH紧密贴合TKB域，使RING域处于“关闭”的非活性构象[9]。TKB域内的关键残基Tyr363被磷酸化后，这种相互作用被破坏，导致LH释放和RING域的旋转，从而使Cbl-b转变为“开放”的催化活性状态。大多数Cbl-b小分子抑制剂旨在针对这一关键的Tyr363残基[9]。通过在关键位点建立特定的相互作用（如π–π堆叠），抑制剂可以有效地稳定自我抑制的“关闭”构象，从而阻断Cbl-b的催化活性[9]。抑制Cbl-b可以显著降低T细胞的激活阈值，并重新激活免疫细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。即使在没有共刺激信号的情况下，也能产生强烈的抗肿瘤免疫反应[10]。

迄今为止，报道的Cbl-b抑制剂主要具有常见的三唑支架结构，例如化合物1–4（由Nurix开发，见图1）[11]、[12]。晶体学分析表明，这些抑制剂主要通过与Tyr363形成π–π堆叠相互作用来抑制Cbl-b。然而，由于TKB域——特别是Tyr363残基——在Cbl家族中的高度结构保守性，这种疏水性结合模式可能无法有效区分Cbl-b及其密切同源物c-Cbl。此外，过度依赖疏水性驱动力的结合模式可能导致物理化学性质不佳，包括水溶性差。尽管已有几种候选化合物进入了一期临床试验，但发现具有更高效力和结构多样性的新型Cbl-b抑制剂仍然是一个重大挑战。

为了克服三唑支架的限制，我们假设在Tyr363引入极性键可以更精确地稳定Cbl-b的非活性状态。这种相互作用具有严格的几何约束和方向性，与相对无方向性的疏水性力相比，在配体-蛋白质相互作用中具有独特优势。这些极性接触使小分子能够精确地补充目标蛋白的结构，降低脱靶效应的风险[13]。

我们选择了最近描述的Cbl-b抑制剂5（见图2）[14]作为起始先导化合物。尽管晶体学分析和对接模型（见图3）表明5与关键残基Tyr363形成了氢键，但其在整个TKB-LH界面上的相互作用仍不足以最大程度地稳定非活性状态。为了克服这些限制，我们采用了支架重塑策略，首先对嘧啶类支架进行优化，然后通过支架跳跃来突破氨基甲酸酯部分的限制。这种方法旨在发现具有新型支架和增强效力的Cbl-b抑制剂，使其能够与Tyr363形成更有效的相互作用，并与Cbl-b建立更优的整体结合网络。

结果与讨论

第一阶段优化：在第一轮优化中，我们最初设计并合成了一系列衍生物（表1中的化合物6–11），通过用各种芳香族生物异构体替换5的中心嘧啶环，同时保留了灵活的酰胺连接基团。为了评估它们与Cbl-b的结合亲和力，我们使用了Nurix专利（WO2020264398A1）中描述的Cbl-b抑制剂和5-FAM标记的荧光探针进行了荧光极化（FP）测定。

利用SeeSAR进行支架跳跃

使用SeeSAR 13.1.0软件进行了支架跳跃。SeeSAR中的Inspirator模块具有创新的片段替换和生物异构体设计功能。该模块通过高效的片段库搜索，可以在保持化合物核心支架空间构象的同时，识别出具有新型物理化学性质的潜在生物活性分子[15]。

在支架跳跃的第一阶段，首先将化合物12导入Inspirator模块中，

结论

总之，以环状氨基甲酸酯抑制剂5为起始先导，我们通过系统的结构优化策略成功设计并合成了一系列新型Cbl-b抑制剂。针对现有抑制剂主要依赖非定向疏水性堆叠的局限性，我们实施了包括支架重塑、疏水空腔填充和支架跳跃在内的三阶段优化过程。

在我们的第一轮优化中，我们发现

实验部分

用于合成Cbl-b抑制剂6–30的所有商业试剂和溶剂均从Bide Pharmatech和Titan Scientific（Tansoole）购买。除非另有说明，这些材料按原样使用，无需进一步纯化。环状氨基甲酸酯系列（方案1）和27系列（方案2）的反应进程通过HSGF-254硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）进行薄层色谱（TLC）监测。

CRediT作者贡献声明

Jinyu Tu：撰写——原始草稿，验证，项目管理，形式分析，数据管理，概念化。Yi Guan：验证，形式分析，数据管理。Xi Gu：验证，研究。Yan Wang：研究，数据管理。Haiwei Shen：监督，项目管理。Ruirui Yang：监督，资源提供。Li Zhang：资源提供。Xingyong Liu：资源提供。Jingyi Zhou：撰写——审阅与编辑，研究，形式分析。Zhili Zuo：撰写——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本项目得到了国家自然科学基金（编号：82574324）、杭州高等研究院研究基金（编号：2025HIAS-ZL007、2025HIAS-ZL018、2024HIAS-C3001）以及中央地方科技发展引导基金项目（编号：2025ZY01022）的财政支持。