一项关于PMAA在三种具有不同极性的商业气相色谱（GC）柱上分离行为的全面研究，旨在提高糖苷键分析的效率

《Bioorganic Chemistry》：A comprehensive study on PMAA separation behaviors across three commercial GC columns with distinct polarities for enhanced glycosidic linkage analysis

多糖甲基化分析中，构建了覆盖八种中性单糖的PMAA标准品库，并系统表征了其在HP-INNOWax、DB-23和Rxi-5ms三种色谱柱上的分离行为，建立了以色谱分离为核心、质谱辅助的标准化分析流程，解决了异构体共流和选择性因子不足的问题。

　　

李晓军|杨志新|陈江|张雪

扬州大学医学院中医学院，中国江苏省扬州市225009

摘要

为了解决多糖甲基化分析中的准确性问题，构建了一个部分甲基化醛糖醋酸盐（PMAAs）的库。这些标准品的色谱行为在三种不同极性的色谱柱上进行了系统表征：高极性（HP-INNOWax）、中极性（DB-23）和低极性（Rxi-5 ms）。生成了一个包含相对保留时间（RRT）、分辨率（Rs）和差向异构体选择性因子（α）的数据集。基于此，首次提出了一种标准化的分析工作流程，以PMAA分离行为数据库为参考，色谱分离为核心，质谱为辅助鉴定方法。通过准确分析普鲁兰和一种杂多糖的糖苷键连接，验证了这一工作流程。本研究提供了一个全面的数据集和分析流程，旨在提高多糖甲基化分析的准确性和标准化。

引言

多糖是丰富的生物大分子，在生物系统中发挥着重要作用，包括结构支持、能量储存和细胞识别。最近的研究表明，植物来源的多糖具有多种生物活性，如抗氧化、免疫调节和抗肿瘤特性[1]、[2]、[3]。这些特性使它们成为功能性食品和药品的有希望的候选物质。然而，多糖的生物活性与其精确结构密切相关[4]、[5]、[6]、[7]。阐明这一结构仍然是糖科学中的一个核心挑战。这种困难源于碳水化合物分子本身的复杂性和微异质性。

甲基化分析是确定多糖糖苷键位置的关键技术。该方法涉及将多糖衍生为部分甲基化醛糖醋酸盐（PMAA），然后使用气相色谱-质谱（GC-MS）进行鉴定[8]。自Purdie和Irvine在1903年的开创性工作以来[9]，甲基化程序已经经历了一个世纪的发展和优化。尽管如此，准确的数据解释仍然具有挑战性[10]。这种困难主要源于PMAAs的结构复杂性。许多单糖本质上是异构的。衍生过程会产生许多保留时间相似且质量碎片模式高度相似的PMAA异构体。因此，仅依赖质谱数据往往难以明确识别复杂多糖中的所有糖苷键[11]。目前，大多数研究人员依赖于与已报道的保留时间和质谱的比较。然而，这些参考数据可能会受到仪器类型、色谱柱条件和特定操作参数的显著影响。因此，建立一套合成的PMAA混合物库进行直接比较被广泛认为是提高鉴定准确性的重要前提[12]。

有效的色谱分离对于PMAAs的准确鉴定至关重要。PMAAs的洗脱顺序高度依赖于气相色谱固定相的极性。对于给定的异构体对，在不同极性的色谱柱上，洗脱顺序可能会反转，并可能发生共洗脱。当发生共洗脱时，由于碎片离子之间的干扰，得到的质谱图会变得扭曲。这可能会掩盖关键的诊断离子，从而导致糖苷键的错误鉴定或遗漏。因此，对于含有复杂单糖组成的多糖，采用互补的双柱分析策略已成为确保可靠结果的共识方法[13]。这种策略包括使用合成PMAA混合物的保留时间和质谱进行双重验证。尽管制备PMAA标准品的方法已经很成熟，且双柱分析的优势也得到了广泛认可（Sassaki等人[14] [8]），但仍存在一个关键的知识空白。缺乏全面、系统的研究来表征不同极性色谱柱上PMAAs的洗脱行为和共洗脱风险。具体来说，关于哪些PMAAs会在特定固定相上不可避免地共洗脱，缺乏系统的实验数据和理论理解。此外，不同固定相对关键异构体对（例如4-Glcp/4-Galp/4-Manp）的分离效果的变化也没有得到很好的描述。此外，选择最佳互补色谱柱对的科学依据也不清楚。因此，当前的双柱分析实践往往依赖于经验性尝试，而不是基于色谱原理的方法设计。

因此，本研究旨在通过系统实验为上述问题提供定量数据和理论基础。构建并系统表征了一个PMAA标准品库，然后开发了一种可靠的方法来提高糖苷键鉴定的准确性。

方法片段

试剂和材料

单糖标准品，包括L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-核糖（纯度≥98%），购自源野生物技术有限公司（中国）。用于方法验证的普鲁兰和来自Aurantii Fructus Immaturus的均质多糖样品分别购自Sigma-Aldrich（美国）和博瑞糖生物技术有限公司（中国）。其他试剂和材料的详细信息见补充部分S1.1。

方法框架的建立

使用优化的部分甲基化衍生协议（包括糖基化、部分甲基化、水解、还原和乙酰化）构建了一个涵盖八种中性单糖（总共代表92个糖苷键）的PMAA标准品库。该库使用三种不同极性的色谱柱进行了系统表征：高极性（HP-INNOWax）、中极性（DB-23）和低极性（Rxi-5 ms）。

结论

本研究建立了一个全面的方法体系。通过系统构建涵盖八种中性单糖的PMAA标准品库，并在三种不同极性的色谱柱上对其进行了表征，涵盖了从制备到鉴定的整个过程。首先，对色谱行为的系统研究揭示了固定相选择性的规律。中极性色谱柱（DB-23）对关键异构体对表现出优异的分离性能

CRediT作者贡献声明

李晓军：撰写 – 审稿与编辑。杨志新：撰写 – 初稿。陈江：撰写 – 审稿与编辑。张雪：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者衷心感谢国家自然科学基金（项目编号82304133和82404830）、江苏省自然科学基金（项目编号BK20230590）、江苏省中医药管理局（项目编号QN202227）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（项目编号KYCX25_4107）的财政支持。