《Bioresource Technology》：Systematic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient synthesis of Lolium perenne antifreeze protein
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本研究利用SCRaMbLE系统构建高效产LpAFP的酵母菌株，通过多组学分析发现TIF2和NPP2基因可显著提高产量，其中TIF2提升100%，NPP2提升75%。敲除PDC1基因后产量再增79.8%。在5L生物反应器中实现1.9g/L的高产，是目前最高水平，且该AFP活性优异，具备工业化潜力。
张向宇|尹秋月|崔中兴|王月峰|齐海山|张磊
天津大学合成生物学与生物制造学院生物工程系，合成生物学国家重点实验室，合成生物学前沿科学中心，中国天津300072
摘要
来自Lolium perenne的抗冻蛋白（LpAFP）是一种高效的冰生长抑制剂，在生物样本的冷冻保存和食品保鲜方面具有巨大潜力。然而，由于宿主细胞与异源LpAFP表达之间的不兼容性，其产量仍然较低。本文采用LoxP介导的进化（SCRaMbLE）技术快速构建了高产LpAFP的Saccharomyces cerevisiae菌株。通过对突变菌株的多组学分析发现，翻译起始因子基因TIF2和核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶基因NPP2通过提高翻译活性和ATP水平分别使LpAFP的产量增加了100%和75%。此外，敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1后，LpAFP的产量比亲本菌株提高了79.8%。通过利用这些工程目标，成功构建了高产菌株zYFW035。在5升生物反应器中进行 fed-batch 发酵实验时，获得了1.9克/升的LpAFP产量，这是迄今为止报道的最高产量。令人惊讶的是，这种LpAFP表现出优异的抗冻活性，显示出在工业规模生产中的巨大潜力。
引言
抗冻蛋白（AFPs）是一类具有抗冻特性的生物大分子，包括热滞后（TH）、抑制冰重结晶（IRI）和改变冰晶形态等功能（Bai等人，2017年；Baskaran等人，2021年）。特别是IRI能力对于生物样本的低温储存（Liu等人，2025年）和食品保鲜（Wu等人，2021年）非常有益。在已知的抗冻蛋白中，Lolium perenne的抗冻蛋白（LpAFP）即使在100℃加热后仍表现出卓越的IRI活性（Gupta和Deswal，2014年；Middleton等人，2012年；Sidebottom等人，2000年）。然而，由于其在自然系统中的产量通常较低以及提取过程复杂且成本高昂（Griffith和Yaish，2004年），LpAFP的生产仍然具有挑战性。
为了解决这些问题，在工程微生物中进行异源表达是一个有前景的解决方案（Xu和Wright，2019年；Zhang等人，2019年）。例如，在利用甲醇的Pichia pastoris系统中表达了Leucosporidium属的抗冻蛋白（LeuAFP），在7升发酵罐中获得了443毫克/升的产量（Lee等人，2013年）。同时，Cryptophilus属和胡萝卜的抗冻蛋白也在P. pastoris中得到生产，产量分别为39.5毫克/升和379.47毫克/升（Liu等人，2018年；Tab等人，2018年）。此外，还有报道在Escherichia coli中成功表达了冬季比目鱼的抗冻蛋白，产量为10毫克/升（Chang等人，2024年）。尽管在抗冻蛋白的异源合成方面取得了一些进展，但要实现高产量仍是一个挑战。
Saccharomyces cerevisiae通常被认为是一种安全的（GRAS）微生物，具有明确的遗传背景，并且非常适合工业加工，同时对化学物质和次级代谢产物具有很强的抵抗力。因此，它经常被用来生成异源蛋白（Zhao等人，2024年）。值得注意的是，SC 2.0计划涉及用合成染色体系统地替换野生型染色体（Doerr等人，2023年；Richardson等人，2017年；Wu等人，2017年；Xie等人，2017年）。作为一种高质量的底盘，合成S. cerevisiae已成功用于生产多种天然产物，如类胡萝卜素（Zhang等人，2022年）、青霉素（Blount等人，2018年）、prodeoxyviolacein（Wang等人，2018年）和虾青素（Jin等人，2022年）等。虽然LoxP介导的进化（SCRaMbLE）系统已成功用于构建多种天然小分子的高产底盘，但尚未有报道关于蛋白质等生物大分子的高效表达。然而，由于与大分子相关的转录、翻译、折叠、修饰和转运过程的特殊性，构建高效的高异源蛋白生产底盘仍然是一个挑战（Daly和Hearn，2005年；Kaur等人，2018年；Popova等人，2023年）。
在这里，我们开发了一种高产的S. cerevisiae菌株用于生产LpAFP。首先，使用SCRaMbLE系统构建了一个基因组文库，并通过流式细胞术进行高通量筛选，鉴定出四个高产菌株。随后对这些菌株进行基因组和转录组分析，确定了促进LpAFP生产的潜在靶基因，这为构建高效底盘菌株提供了指导。具体来说，研究阐明了TIF2和NPP2在促进蛋白质合成中的作用，并强调了下调乙醇代谢基因PDC1对LpAFP产量的关键影响。基于这些发现，成功构建了高产菌株zYFW035。
菌株和培养条件
质粒转化和克隆在E. coli BL21（DE3）中进行，该菌株在LB培养基（10克/升蛋白胨、5克/升NaCl、5克/升酵母提取物）中培养。S. cerevisiae菌株yFJ440被用作本研究中DNA转化和组装的初始宿主。它分别在YPD培养基（20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、10克/升酵母提取物）、SC-His培养基（不含组氨酸、含有20克/升葡萄糖）、SC-Gal培养基（不含组氨酸、含有20克/升半乳糖）和5-氟-orotic酸培养基中培养。
用于高产LpAFP菌株的SCRaMbLE
蛋白质LpAFP-GFP通过同源重组整合到合成染色体V的CAN1位点（YEL063C）中，替换了预先插入的URA3标记，从而生成了单倍体菌株zYFW006（图1a）。之后，使用SCRaMbLE系统生成了多种基因型和表型文库。Cre酶活性通过葡萄糖抑制、半乳糖诱导的AND门pCRE4（pGal1-Cre-EBD-tCYC1）精确控制，该系统利用Cre-EBD融合来实现严格的
结论
本文利用合成S. cerevisiae通过SCRaMbLE系统构建了一个用于高效生产LpAFP的突变文库。多组学分析发现了13个潜在的增强LpAFP生产的靶基因，其中TIF2和NPP2被证明是最有效的。TIF2编码一个关键的翻译起始因子，通过增强整体翻译来提高蛋白质表达。相反，破坏NPP2（编码核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶）的基因会
CRediT作者贡献声明
张向宇：撰写初稿、软件开发、方法设计、数据管理、概念构思。尹秋月：撰写初稿、实验设计、数据管理、概念构思。崔中兴：数据可视化、实验分析。王月峰：结果验证、实验分析。齐海山：撰写与编辑、项目监督、概念构思。张磊：撰写与编辑、项目监督、资源协调、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFC2104800）、国家自然科学基金（22525804、22508295、22478296）以及合成生物学国家重点实验室自主创新基金（HCZC-202604A）的支持。
