通过检测脂滴极性来识别非酒精性脂肪性肝炎和炎症的分子工程溶质致变色荧光探针

《Dyes and Pigments》：Molecularly engineered solvatochromic fluorescent probes for the recognition of nonalcoholic steatohepatitis and inflammation by the detection of lipid droplet polarity

非酒精性脂肪肝炎（NASH）诊断面临灵敏度与特异性不足的挑战，本研究设计四类溶致变色荧光探针（LDP1-LDP4），通过π共轭延伸与供体-受体电子调控策略优化探针性能。其中LDP3兼具适宜脂溶性、高极性敏感性及抗粘度干扰能力，可在活细胞和动物模型中精准靶向脂滴（LDs），实时监测脂滴极性动态变化，成功区分NASH患病与正常小鼠。该探针为NASH无创诊断提供新工具。

　　

Jingjie Liang|Lanqing Li|Lei Chen|Wen-Hua Chen

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）在全球范围内极为普遍，其主要特征是脂滴（LDs）的过度积累和炎症反应。作为一种有前景的无创方法，溶致变色探针，特别是那些能够特异性靶向脂滴并对极性具有高敏感性的探针，可能为NASH的诊断提供一种强大的工具。在此，我们采用合理的分子工程策略设计了四种溶致变色探针（LDP1至LDP4），这些探针具有显著的溶致变色效应和高极性敏感性。其中，LDP3表现出适宜的亲脂性、良好的光稳定性和对极性的高敏感性，并且不受粘度的影响。LDP3能够选择性地定位于脂滴中，并有效监测活细胞和炎症动物模型中脂滴的极性及其状态的变化。值得注意的是，LDP3在体内（in vivo）对NASH的识别能力非常强，能够区分受影响的小鼠和健康小鼠。这些发现表明LDP3可以通过监测脂滴内的极性作为NASH的诊断工具。

引言

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种常见的、严重的代谢功能障碍相关脂肪肝疾病[1]、[2]。NASH是一个关键的进展阶段，其特征是肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，并可能发展为不可逆的肝硬化、肝衰竭或肝细胞癌[3]、[4]。由于目前临床上尚无有效的NASH治疗药物[5]，因此及时准确地诊断NASH对于防止病情恶化和死亡至关重要。目前，肝活检仍是诊断NASH的“金标准”，但它存在一些固有的缺陷，如侵入性以及样本采集和分析的一致性问题[6]。已经开发了多种技术来监测NASH，包括超声波（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）[7]。尽管这些方法具有临床实用性，但它们仍面临显著的局限性，例如检测早期NASH的敏感性不足、容易受到肥胖的干扰，以及空间分辨率相对较低。尽管新开发的MRI造影剂（特别是使用钆或超小氧化铁的造影剂[8]、[9]、[10]）在NASH诊断方面取得了显著进展，但它们在体内的长期积累可能会引起严重的副作用。相比之下，荧光探针通过靶向关键生物标志物（如活性氧（ROS）、活性氮物种（RNS）、pH值、酶、谷胱甘肽（GSH）和微环境极性）提供了一种无创的可视化策略。此外，荧光探针在生物标志物的识别方面表现出优异的性能，具有高敏感性、选择性、出色的空间分辨率和实时成像能力。

值得注意的是，NASH的准确识别在很大程度上依赖于相关生物标志物的准确选择。由于脂滴（LDs）作为动态细胞器的关键作用，在NASH的发展和进展中起着重要作用[11]。脂滴不仅通过隔离游离脂肪酸来减轻细胞脂毒性损伤，还通过储存和动员中性脂质来调节脂质稳态，从而为细胞提供能量和膜合成前体[12]、[13]、[14]。在NASH进展过程中，异常的脂质代谢导致脂质积累和脂滴形成，同时伴随着脂滴极性的变化[15]。因此，脂滴及其极性的动态变化可以作为监测NASH进展的重要指标。

迄今为止，已经开发出多种针对脂滴的极性敏感荧光探针，并在多种疾病的成像中展示了显著的价值[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。其中，具有脂滴靶向能力的溶致变色染料因其对局部微环境极性的敏感反应而受到了广泛关注[23]。特别是，研究人员正在积极开发具有较大斯托克斯位移的脂滴探针，因为这一特性可以有效解决共聚焦成像中的严重串扰和自吸收问题（表S1）。对于溶致变色探针，这些分子通常具有推拉电子结构，因此在激发状态下可以发生分子内电荷转移（ICT），这导致它们的激发态偶极矩增加，从而使其发射光谱显著受到环境极性变化的影响[24]、[25]。

然而，当这些探针用作极性指示剂时存在一些固有的局限性。首先，已知生物系统内的极性变化通常伴随着微环境粘度的变化[26]、[27]，而许多探针的荧光响应容易受到粘度干扰，这可能会降低它们对极性变化的特异性。其次，大多数针对脂滴的探针具有高度疏水性，在细胞的水环境中容易聚集[28]、[29]，导致荧光淬灭，限制了在活细胞成像中的实际应用。更重要的是，很少有探针具有显著的溶致变色效应，从而导致极性敏感性较弱。最后，一些经典的溶致变色探针，如Laurdan[30]、[31]和Nile Red[32]，光稳定性不足，对极性的敏感性也较低[24]、[33]。

考虑到这些因素，我们在此报告了四种极性敏感的溶致变色荧光探针LDP1-LDP4（图1），用于体内（in vivo）成像NASH和监测炎症。这些探针是通过分子工程策略设计的，通过在喹啉骨架上结合π-共轭扩展和供体-受体（D-A）电子调控构建的。LDP1-LDP4在单分散态和固态下均表现出强烈的荧光和高的荧光量子产率（Φ_F），以及显著的溶致变色效应和极性敏感性。其中，LDP3表现出适宜的亲脂性和对极性的最佳荧光响应。它不仅能够选择性地定位于脂滴中，还能有效检测活细胞中脂滴的极性及其状态的变化。值得注意的是，LDP3能够在体外（in vitro）和体内（in vivo）炎症模型中可视化脂滴极性的降低。此外，进一步的体内成像实验验证了LDP3在识别NASH疾病方面的潜力。

材料与设备

核磁共振（NMR）光谱是使用Bruker AVANCE-500光谱仪（¹H频率500 MHz，¹³C频率125 MHz）在22°C下获得的，原始数据使用MestReNova软件（版本14.2.0，Mestrelab Research S.L.）进行处理。高分辨率质谱（HRMS）光谱是在配备ESI离子源的质谱仪（Thermo Scientific? Q Exactive?）上获得的。每种化合物都溶解在MS级甲醇中，浓度为2 μg/mL。

LDP1-LDP4的设计与合成

电子供体（D）和受体（A）是设计极性响应型、靶向脂滴的荧光探针的两个关键组成部分。D-A结构所固有的高效ICT效应容易触发其强烈的溶致变色效应，并进一步提高敏感性。在此，我们构建了不对称发光体，包括一种D-A-D类型（LDP1）和三种D-A-π-D类型（LDP2-LDP4）（图2A），其中喹啉部分作为电子受体核心（A），三苯胺和N,N

结论

总结来说，我们设计并合成了四种新型的D-A-D型荧光探针LDP1-4。这些探针表现出显著的溶致变色效应和高极性敏感性。其中，LDP3具有适宜的亲脂性和对极性的高敏感性，因此被选为进一步生物评估的最佳探针。该探针不仅能够选择性地定位于脂滴中，还能有效检测体外（in vitro和体内（in vivo）脂滴的极性及其状态的变化。

CRediT作者贡献声明

Lei Chen：资金获取、数据分析。Lanqing Li：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、监督、资源协调、资金获取、数据分析、概念构思。Wen-Hua Chen：写作 – 审稿与编辑、监督。Jingjie Liang：数据分析

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

数据可用性

数据将根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明没有可能不恰当地影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了广东省基础与应用基础研究基金会（2022A1515110134）和国家自然科学基金（82300963）的财政支持。