《Experimental Cell Research》：MDK promotes the mast cell activation and pancreatic fibrosis in mice with chronic pancreatitis via MDK-NCL signaling pathway
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慢性胰腺炎（CP）的发病机制涉及胰腺星状细胞（PSCs）与肥大细胞的相互作用，其中MDK-NCL信号轴起关键作用。通过单细胞RNA测序和生物信息学分析发现，CP小鼠中PSCs和肥大细胞显著上调MDK/NCL表达，并分泌纤维化标志物（α-SMA、Collagen I）和炎症介质（HIS、NGF、IL-18）。功能验证显示，敲低PSCs中的MDK可抑制激活和纤维化，同时减少肥大细胞的增殖和脱颗粒，而重组MDK可逆转此效应。动物模型中，MDK/NCL敲除显著降低细胞浸润和胰腺损伤。因此，MDK-NCL轴通过调控PSCs与肥大细胞的交互促进CP纤维化和炎症，为治疗提供新靶点。
Jianbin Xiong|Jian Song|Xing Jiang|Zhuanzhuan Huang|Yijie Zhang
贵州省医科大学附属医院胰腺炎中心，中国贵阳，561113
摘要
慢性胰腺炎（CP）的特征是胰腺内持续存在炎症和纤维化，但其确切的发病机制尚不清楚。为了研究其潜在机制，我们分析了人类慢性胰腺炎的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE208536），以探讨细胞聚类和细胞间通讯情况，并建立了一个二丁基锡二氯化物（DBTC）诱导的慢性胰腺炎小鼠模型。使用流式细胞术分析细胞表型并对细胞进行分选。生物信息学分析显示，胰腺星形细胞（PSCs）和肥大细胞在慢性胰腺炎的进展中起关键作用，特别是midkine（MDK）-核仁蛋白（NCL）配体-受体对的表达显著增强。在慢性胰腺炎小鼠中，我们观察到纤维化标志物（α-SMA、Collagen I、FN1）和肥大细胞介质（HIS、MCT、NGF、C-kit、IL-18）的同时上调，同时MDK/NCL的表达也升高，PSCs和肥大细胞均发生浸润。功能验证表明，抑制PSCs中的MDK表达可以减少其活化及纤维化，并抑制肥大细胞的增殖和脱颗粒反应；而重组MDK则可以逆转这些效应。此外，中和NCL蛋白可以阻断野生型细胞培养中的肥大细胞活化。重要的是，在体内敲低MDK或NCL可减少细胞浸润和活化，从而减轻胰腺损伤和纤维化。综上所述，MDK-NCL轴参与了PSCs与肥大细胞之间的相互作用，加剧了慢性胰腺炎的纤维化和炎症。这些发现为慢性胰腺炎的发病机制提供了新的见解，并确定了MDK-NCL轴作为未来功能研究的候选目标。
引言
慢性胰腺炎是一种难治性疾病，其特征是胰腺纤维化进展、腺泡细胞萎缩和慢性炎症。其病理过程复杂，最终往往导致外分泌和内分泌胰腺功能不可逆地丧失[1]。同时，患者可能出现多种症状，包括腹痛、恶心、体重下降、脂肪泻和糖尿病[2]。全球慢性胰腺炎的患病率正在上升[3]，因此阐明其分子机制对于开发有效治疗方法尤为重要。
胰腺纤维化是慢性胰腺炎的核心病理特征[4]。PSCs是这一纤维化过程中的关键细胞，它们位于胰腺的外分泌区域[5]、[6]。活化的PSCs在慢性胰腺炎的发病中起重要作用[7]，会向肌成纤维细胞表型转变，并在慢性胰腺炎期间增加细胞外基质（ECM）蛋白的产生[8]、[9]。进一步的研究表明，PSCs上表达的CCK1和CCK2受体可促进胶原蛋白的生成[10]。因此，抑制PSCs的活化已被证明可以缓解慢性胰腺炎[11]，而诱导活化PSCs凋亡可以改善相关纤维化[12]。因此，抑制PSCs的活化、增殖和迁移是研究慢性胰腺炎发病机制和治疗方法的重点。
除了纤维化机制外，免疫反应也起着关键作用。在这一复杂的免疫环境中，肥大细胞作为先天性和适应性免疫的关键调节者，其作用日益受到重视。与中性粒细胞在急性炎症中的快速反应不同，肥大细胞通过预先储存和新合成的生物活性介质（如组胺（HIS）、肥大细胞胰蛋白酶（MCT）、神经生长因子（NGF）以及多种细胞因子和生长因子）长期、持续地重塑组织微环境[13]、[14]。值得注意的是，慢性胰腺炎患者的肥大细胞数量显著增加，它们聚集在残余的腺泡组织周围，并参与胰腺组织的破坏[15]、[16]。急性胰腺炎（AP）是慢性胰腺炎的已知风险因素。人类肥大细胞可以直接分泌白细胞介素-18（IL-18），后者在急性胰腺炎的进展中起重要作用，并与多种纤维化疾病（包括肝纤维化、心脏纤维化和肺纤维化）相关[17]、[18]、[19]。因此，肥大细胞也可能参与慢性胰腺炎中的胰腺纤维化过程，尽管具体机制尚不清楚。
尽管PSCs活化和肥大细胞浸润在慢性胰腺炎中的作用逐渐得到认可，但介导它们之间病理相互作用的精确分子机制仍是一个重要的知识空白。为此，我们采用了基因表达分析和生物信息学方法来探索疾病进展机制并识别关键介质。通过细胞间通讯分析，我们发现MDK-NCL配体-受体对在慢性胰腺炎背景下PSCs与肥大细胞之间的相互作用中显著上调。MDK是一种神经营养因子，在胚胎发生过程中高度表达，具有与生长、增殖、存活、迁移、血管生成、繁殖和修复相关的重要功能[20]。AP患者中MDK表达升高，可能参与胰腺再生[21]。重组MDK蛋白也有助于促进AP中的胰腺病变恢复[21]。在胰腺炎中，星形细胞表达更高水平的MDK，其受体NCL是一种通常与RNA合成和处理相关的核蛋白[22]，还参与调节细胞周期、凋亡和DNA修复等过程[23]。
近年来，MDK-NCL轴被认为是一种在疾病进展和细胞相互作用中起关键作用的新兴信号通路。目前关于MDK-NCL轴的研究主要集中在肿瘤领域。子宫内膜癌细胞通过MDK-NCL信号通路诱导内皮细胞发生恶性转化，NCL与免疫抑制有关[24]。肺腺癌细胞利用MDK-NCL信号通路调节肿瘤微环境（TME），抑制上皮细胞的免疫活性并增强恶性程度[25]。多囊卵巢综合征患者的MDK-NCL相互作用显著增强，尤其是在卵泡膜细胞（TC2亚群）与其他卵巢细胞之间，这会促进炎症和代谢功能障碍，恶化卵巢微环境[26]。此外，活化的成纤维细胞主要通过激活MDK/NCL促进淋巴内皮细胞的管状形成。然而，MDK-NCL信号通路在慢性胰腺炎中的作用及其是否参与调节PSCs与肥大细胞之间的相互作用仍不清楚。
因此，本研究旨在探讨MDK-NCL轴在调节PSCs和肥大细胞功能中的作用，并阐明其对慢性胰腺炎发病机制的影响。
数据片段
scRNA-seq和生物信息学分析
scRNA-seq数据集（GSE208536）来自GEO数据集。使用Scanpy进行了数据质量控制、过滤、降维、聚类和差异表达分析。具体来说，筛选条件为ngenes_by_counts > 200、ngenes_by_counts < 6000、pct_counts_mt < 5以及total_counts < 50,000，并使用normalize_total对数据进行标准化处理。通过sc.pp.highly_variablegenes()方法筛选出高度变异的基因。随后进行了主成分分析（PCA）。
慢性胰腺炎中异质细胞类型的转录组特征
为了表征慢性胰腺炎期间的细胞异质性，我们基于转录组特征对对照组和慢性胰腺炎组的scRNA-seq数据进行了无偏聚类分析。图1A显示了两组的细胞簇分布图，可见两组细胞高度混合，没有形成明显的独立亚群。使用Leiden聚类方法共识别出14个簇（图1B）。
讨论
慢性胰腺炎是一种多因素引起的纤维炎症综合征，目前尚无根治性治疗方法[1]。胰腺纤维化是由于反复坏死过程中ECM和胶原纤维过度沉积所致[28]。PSCs是位于腺泡细胞、小血管和胰管周围的多能效应细胞[29]。免疫细胞在胰腺炎的发病机制中起关键作用，并决定了疾病的严重程度[30]。肥大细胞是主要的效应细胞
CRediT作者贡献声明
Xing Jiang：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、数据分析。Zhuanzhuan Huang：撰写——审稿与编辑、验证、软件应用、方法学、实验设计。Jianbin Xiong：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、数据分析、概念构建。Jian Song：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构建。Yijie Zhang：撰写——审稿与编辑、项目监督、资源协调。
数据获取
本研究生成和/或分析的所有数据可应要求向通讯作者索取。
伦理审批
所有动物实验均获得贵州省医科大学附属医院实验动物伦理委员会的批准。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
