“颠覆传统药物使用方式”：紫光与两性霉素B通过协同作用及针对宿主的机制增强抗利什曼病效果

《Experimental Parasitology》：De-centering the Drug: Violet Light and Amphotericin B Enhance Antileishmanial Activity Through Additive and Host-Directed Effects

皮肤利什曼病治疗研究显示，紫色LED光疗（400±10 nm）与低剂量两性霉素B（0.05-0.50 μM）联合能显著抑制美洲、巴西和主要利什曼原虫的成虫滋养体及巨噬细胞内虫体。光 fluence 9.0 J/cm2 时联合效果最突出，同时激活宿主一氧化氮免疫应答，降低感染率。Bliss分析表明二者作用以加性为主，具有光疗协同增效潜力。该策略可降低毒性并提高疗效，为开发新型联合疗法提供依据。

　　

布鲁诺·佩雷拉·迪尼兹（Bruno Pereira Diniz）|塞西莉亚·卢伊扎·佩雷拉（Cecília Luiza Pereira）|塔希拉·索扎·梅洛（Tahira Souza Melo）|大卫·斯坦伯格（David Steinberg）|恩里克·吉马良斯·罗萨（Henrique Guimar?es Rosa）|乔瓦娜·玛丽亚·萨尔马齐·德·卡瓦略（Giovana Maria Salmazi de Carvalho）|克劳迪奥·维埃拉·达·席尔瓦（Claudio Vieira da Silva）|埃利达·克里斯蒂娜·蒙特罗·德·奥利维拉（Elida Cristina Monteiro de Oliveira）|詹·卡洛·莫拉伊斯·奥利维拉·贝尔塔索尼·德洛伦齐（Jan Carlo Morais Oliveira Bertassoni Delorenzi）|克里斯蒂亚诺·何塞·圣地亚哥·德·马托斯（Christiano José Santiago de Matos）|埃乌内齐奥·安东尼奥·托罗赫·德·索扎（Eunézio Antonio Thoroh de Souza）

巴西圣保罗市麦肯齐长老会大学（Mackenzie Presbyterian University）工程学院

摘要

皮肤利什曼病（Cutaneous Leishmaniasis, CL）是一种被忽视的热带疾病，其现有治疗方法具有较高的毒性、高昂的成本，且寄生虫逐渐产生抗药性，这凸显了寻找替代治疗策略的必要性。在这一背景下，光-药物联合疗法成为提高疗效、减轻药物负担的有前景的方法。本研究评估了紫光LED光疗（400 ± 10 nm）与两性霉素B（Amphotericin B, AmB）联合使用对Leishmania amazonensis、L. braziliensis和L. major前鞭毛体以及被L. amazonensis前鞭毛体感染的RAW 264.7巨噬细胞的影响。与单一疗法相比，联合治疗显著降低了寄生虫的存活率，尤其是在较高光强度（9.0 J cm^-2）下效果更为显著。在受感染的巨噬细胞中，联合治疗降低了感染率并增强了一氧化氮（NO）的生成，表明激活了宿主的抗菌机制。为了定量评估这两种治疗方法之间的相互作用，我们进行了Bliss独立性分析。结果表明，这种相互作用主要是叠加效应，在特定实验条件下存在依赖性的增强作用，而非始终具有协同效应。总体而言，这些发现表明紫光和低剂量AmB可以共同改善抗寄生虫效果，同时调节宿主-病原体之间的相互作用。这种方法代表了一种有前景、可获取且潜在毒性较低的CL治疗策略，值得在体内模型中进行进一步研究。

引言

利什曼病是由世界卫生组织列为被忽视的热带疾病（Neglected Tropical Disease, NTD）的一种寄生虫病，影响着数百万边缘化社区，每年新增病例接近两百万例（WHO, 2022）。

其病原体属于Leishmania属的原生动物，通过Lutzomyia（美洲）和Phlebotomus（亚洲、非洲、欧洲）属的沙蝇传播（Burza et al., 2018）。寄生虫在昆虫体内的细胞外前鞭毛体阶段与哺乳动物巨噬细胞内的细胞内前鞭毛体阶段之间循环。

在巴西，治疗手段有限且面临诸多挑战（Brasil, 2017）。虽然N-甲基葡萄糖胺锑盐是一线治疗药物，但两性霉素B（AmB）作为二线选择却因严重的不良反应和高毒性而难以广泛应用，常常导致治疗中断（Alborzi et al., 2017; Frézard et al., 2023）。

利什曼病仍然是一种与贫困和治疗资源有限相关的被忽视疾病，反映了流行地区持续存在的健康不平等问题（Chakravarty and Sundar, 2019）。

在这种情况下，光疗成为一种潜在的治疗策略。紫光（约400–405 nm）对细菌、真菌和包括Leishmania在内的原生动物具有抗菌活性，支持其作为抗利什曼病方法的潜力（Kang et al., 2019; Schubert et al., 2018; Kaldone et al., 2024）。

本研究旨在超越传统的“联合疗法”模式。我们假设紫光和AmB可能产生增强或协同作用（Souza et al., 2023），即通过联合调整宿主-病原体系统，产生大于各部分之和的治疗效果。

我们选择AmB是因为其已证实的有效性，但其毒性问题较为突出（Ponte-Sucre et al., 2017）。我们的目标是确定在低浓度（0.05 μM至0.50 μM）下光疗是否能够增强其效果，这些浓度基于先前确定的L. amazonensis的IC₅₀值（Souza et al., 2020）选择。

我们测试了两种光强度：4.5 J.cm^-2（光疗1）和9.0 J.cm^-2（光疗2），这些强度通常用于体外光疗研究（Fagundes et al., 2019）。在基于光疗的方法中，选择适当的照射参数对于平衡抗菌效果和宿主细胞安全性至关重要。先前的体外研究表明，光强度≤10 J·cm^-2通常能有效降低微生物存活率，同时最小化对哺乳动物细胞的细胞毒性（Pinto et al., 2015; Pinto et al., 2016; Fagundes et al., 2019）。基于这一原理，我们选择了该范围内的光强度值，以确保生物学效果的同时不超出光毒性阈值。这项来自巴西机构的研究旨在探索一种低成本、易获取且可能毒性较低的治疗策略。

我们旨在评估这种光-药物组合是否能够降低寄生虫存活率和巨噬细胞感染率，提出了一种治疗皮肤利什曼病的新方法。

部分内容摘录

寄生虫和细胞培养

Leishmania amazonensis（IOCL 0575, IFLA/BR/1965/PH8, 2011）、L. braziliensis（IOC-L0566, MHOM/BR/1975/M2903, 2011）和L. major（IOC-L0581, MHOM/SV/1973/5/ASKA, 2011）的前鞭毛体形式在添加了10%胎牛血清（FBS）的Medium 199培养基中于26°C下培养。所有实验均使用处于静止生长期（第5天）的寄生虫。

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7在添加了10%热灭活FBS的RPMI 1640培养基（Sigma-Aldrich, USA）中培养。

光疗对巨噬细胞的低细胞毒性

为了评估该治疗策略对宿主细胞的安全性，我们在相同条件下评估了RAW 264.7巨噬细胞的存活率。大多数情况下，尤其是单独使用较低光剂量（光疗1）或与AmB联合使用时，细胞存活率保持在80%以上，表明其细胞毒性较低（图1）。

光-AmB组合降低前鞭毛体存活率

我们首先评估了这种治疗组合对三种Leishmania物种前鞭毛体存活率的影响。在所有物种中，单独使用光疗或与AmB联合使用均降低了寄生虫的存活率

讨论

利什曼病的管理仍然是一个全球性的健康挑战，主要依赖有毒且昂贵的药物，同时寄生虫抗药性的出现进一步加剧了这一问题，尤其影响弱势群体（Chakravarty and Sundar, 2019; Shmueli and Ben-Shimol, 2024）。

本研究提供了体外证据，表明紫光LED光疗与亚抑制浓度

结论

本研究首次表明，紫光LED光疗与低剂量两性霉素B的联合疗法在体外对Leishmania的前鞭毛体和前鞭毛体形式均有效。通过增强两性霉素B的抗寄生虫活性并同时刺激宿主的先天免疫反应，这种联合方法成为治疗皮肤利什曼病的一种有前景的策略。研究结果支持这一策略在降低

作者贡献声明

乔瓦娜·玛丽亚·萨尔马齐·德·卡瓦略（Giovana Maria Salmazi de Carvalho）：方法学研究。恩里克·吉马良斯·罗萨（Henrique Guimar?es Rosa）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写。克劳迪奥·维埃拉·达·席尔瓦（Claudio Vieira da Silva）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写。埃利达·克里斯蒂娜·蒙特罗·德·奥利维拉（Elida Cristina Monteiro de Oliveira）：软件应用，方法学研究。塞西莉亚·卢伊扎·佩雷拉（Cecília Luiza Pereira）：监督工作，软件应用，方法学研究。布鲁诺·佩雷拉·迪尼兹（Bruno Pereira Diniz）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，监督工作，软件应用，项目管理，方法学研究，概念构思。

未引用参考文献

Kaldhone et al., 2024;

数据获取

本研究的数据可应要求向通讯作者索取。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

关于手稿准备中人工智能（AI）使用的声明

我们作为上述手稿的作者，特此声明以下关于生成式人工智能（AI）工具的使用情况：

本手稿完全由人类作者独立撰写，未使用任何AI工具生成或重写文本、总结信息或辅助内容结构。

作者责任

所有作者确认他们对本文的构思、执行和撰写做出了贡献，并对其内容承担全部责任。我们还确认本文是原创的，尚未提交给其他任何期刊，也未被其他期刊考虑。

诚挚地，布鲁诺·P·迪尼兹（Bruno P. Diniz）代表所有合作者。

利益冲突声明

我们作为本文作者，声明以下潜在的利益冲突：

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。本研究未接受任何可能从研究成果中获益的公司或组织的财务支持。

致谢

本研究得到了CNPq（授权号：140109/2021-8）和麦肯齐长老会大学的支持。

本文在高等教育人员改进协调委员会（CAPES）的支持下以开放获取方式发表，该委员会通过国家的科研促进和科学传播政策提供了支持。