《International Journal of Hydrogen Energy》：Prolonged algal H2 production in a two-compartment membrane-bioreactor with O2 absorbent and humidity control
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为解决微藻产氢过程中氢酶易被氧气不可逆失活、低氧环境难以维持导致产氢时间短的核心问题，研究人员开发了一种两室隔膜生物反应器，通过疏水PTFE膜将高浓度莱茵衣藻pgr5突变体培养物与铁基吸氧剂物理隔离，并结合硅胶干燥剂控制湿度，实现了连续除氧和长达12天的持续低氧维持。在强光（350 μmol photons m?2s?1）和30 °C条件下，该系统获得高达1350 ± 80 μL H2mL?1的累积产氢量，证明了膜辅助除氧和产物气体管理是延长藻类产氢的有效工艺工程策略。
氢能（H2）因其高能量密度和燃烧过程零碳排放，被视为化石燃料极具潜力的替代品。然而，目前全球工业制氢仍严重依赖蒸汽甲烷重整等化石燃料工艺，伴随着大量的二氧化碳排放。为实现脱碳目标，开发绿色的制氢技术迫在眉睫。目前，利用可再生能源驱动的电解水制氢是主流“绿氢”技术，但其发展仍受制于高能耗、高成本以及对稀缺贵金属催化剂的依赖。令人惊奇的是，自然界中的微藻早已掌握了利用太阳能和水生产氢气的“秘密”。在莱茵衣藻等绿藻中，光合作用光反应分解水产生的电子和质子，可以在一种名为[FeFe]-氢酶的催化下，重新结合生成氢气。这听起来像是一个完美的太阳能-氢能转换方案，但实现起来却困难重重。最大的障碍之一是氧气，这个光合作用光反应的“副产品”，会不可逆地使[FeFe]-氢酶失活。与此同时，光合作用暗反应（卡尔文-本森-巴沙姆循环）会与氢酶激烈竞争电子，将绝大部分电子流引向二氧化碳固定。因此，在自然条件下，藻类的产氢过程往往只是昙花一现，仅能维持数分钟。如何为氢酶创造一个稳定、持久的低氧“工作环境”，并让更多光合电子流向产氢而非固碳，是科学家们数十年来努力攻克的核心难题。
为了回答这些挑战，瑞典哥德堡大学的研究人员开展了一项创新性的研究，相关成果发表在《International Journal of Hydrogen Energy》上。他们的核心思路是通过精妙的工艺工程，而非对藻类本身的基因进行复杂改造，来长期维持培养液中的缺氧状态，从而延长产氢时间。
研究人员为开展此项研究，运用了几个关键的技术方法。首先，他们设计并构建了一个核心实验装置——两室隔膜生物反应器，利用疏水的聚四氟乙烯膜将藻类培养室与吸氧剂室物理隔离，实现气体交换而避免细胞与吸氧剂直接接触。其次，他们采用了光学溶解氧传感系统，在培养液和吸氧剂顶空气体中植入非侵入式传感器，实现了对整个产氢过程中氧气动态的实时、连续监测。第三，他们使用气相色谱法定期定量分析两个反应室顶空气中的氢气和氧气浓度，以精确计算累积产氢量。最后，他们利用便携式叶绿素荧光仪，通过测量OJIP快速荧光诱导动力学，评估了在不同处理条件下光合系统II的性能状态，为解释产氢效率差异提供了生理学依据。
3.1. 培养室微氧条件的建立与维持
研究人员首先测试了隔膜生物反应器维持低氧环境的能力。他们将浓缩的pgr5藻株培养物置于反应器一侧，另一侧放置铁基吸氧剂。密封反应器并对培养室顶空进行短暂氮气吹扫后，溶解氧在20分钟内迅速降至接近零，并在此后7天内维持在极低的微氧水平。然而，在密封且光照的生物反应器内，高湿度会降低吸氧剂的效率。为此，研究人员在吸氧剂中添加了硅胶干燥剂来控制湿度。这一改进显著提升了吸氧剂的长期性能，使得相同的吸氧剂量能够在无需补充的情况下，将培养液的低氧状态稳定维持长达12天。这一结果证明，膜分离结合湿度控制的策略，能够有效实现并延长藻类培养的液相缺氧环境。
3.2. 长期微氧条件下的氢气生产
在成功建立稳定低氧环境的基础上，研究人员测定了pgr5藻株的产氢性能。在包含吸氧剂和干燥剂的优化系统中，pgr5培养物在12天的实验期内持续产氢。然而，由于反应器顶空体积相对较小，产生的氢气会快速累积，较高的氢气分压会反过来促使氢酶催化逆反应（吸氢），导致净产氢停滞甚至下降。实验发现，当顶空氢气浓度超过约2.5%时，净产氢即受到抑制。为了克服产物抑制，研究人员尝试更频繁地用氮气吹扫移除顶空氢气，从每24小时一次增加为每8-12小时两次。这一简单的操作管理带来了显著的效果：累计产氢量从540 ± 50 μL H2mL-1大幅提升至1350 ± 80 μL H2mL-1，平均产氢速率也相应提高。这表明，在维持低氧的同时，有效管理产物气体、降低氢气分压，是最大化净产氢量的关键。
3.3. 有无暗预处理对氢气生产的影响
在传统的藻类产氢Protocol中，常在光照前设置一个黑暗孵育期，让细胞通过呼吸消耗氧气以建立缺氧条件。本研究比较了“延长氮气吹扫后直接照光”和“短暂氮气吹扫后暗处理再照光”两种策略。结果显示，尽管两种方法都能最终建立低氧环境，但采用暗预处理的组别，其累计产氢量比直接照光组低了约1.6倍。为探究其原因，研究人员监测了暗处理后刚开始照光时的溶解氧动态，发现存在一个急剧的氧气峰值，这可能是由于暗处理期间光合机构处于“待机”状态，照光瞬间光合放氧速率超过消耗速率所致。这个短暂的氧气峰可能对氢酶活性造成冲击。
3.3. 存在或不存在初始暗孵化阶段时氢气生产期间的光合性能
为了从光合生理角度理解暗预处理的不利影响，研究人员通过叶绿素a荧光OJIP瞬变分析了光合系统II的性能。结果显示，与直接照光或新鲜对照细胞相比，经过暗预处理的细胞，其PSII的最大光化学效率明显降低，反映PSII受体侧早期限制程度的参数Vj显著升高，整体性能指数大幅下降。这表明，暗处理使得PSII的电子传递链在照光初期就处于一种严重的受体侧限制状态，光合电子传递能力受损，从而可能减少了流向氢酶的有效电子流。这为暗预处理导致产氢量降低提供了直接的生理学证据。
综上所述，本研究成功开发了一种创新的两室隔膜生物反应器系统，将工艺工程的重点放在了“环境控制”上。该系统通过一个疏水透气膜，将藻类培养物与铁基吸氧剂物理隔离，实现了连续、温和的除氧，同时利用硅胶干燥剂对抗湿度对吸氧剂性能的负面影响，从而将培养液的缺氧状态稳定维持了12天。在此持久低氧平台的基础上，结合高光强、高细胞密度培养以及频繁的产物氢气移除等优化条件，使用pgr5突变藻株实现了迄今为止文献报道中最高的累计产氢量之一。研究还进一步证实，在现有体系下，省略传统的暗处理步骤，采用延长氮气吹扫后直接照光的策略，有助于保持PSII的光合效能，从而获得更高的产氢量。这项工作的意义在于，它清晰地表明，在追求高效光合生物制氢的道路上，除了对生物体本身进行遗传改造，精妙的反应器设计、智能的环境参数（如氧气、湿度、气体分压）控制和优化的操作流程，同样是决定成败的关键工艺工程策略。这为未来藻类产氢技术从实验室走向规模化、产业化应用提供了重要的概念验证和实践参考。
