《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Efficient hybridoma screening using extracellular vesicles for conformation-specific antibodies to transmembrane proteins
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基于外泌体的膜型免疫球蛋白筛选平台可高效分离识别跨膜蛋白三维构象的单克隆抗体，该技术利用外泌体天然脂双层保持抗原构象，结合MIHS方法通过荧光激活细胞分选避免传统ELISA破坏抗原结构，实验验证显示该方法能有效捕获结构特异性抗体，为生物学研究和抗体开发提供新策略。
Rina Sakamaki | Takao Matsuba | Yasuyuki Kurihara
横滨国立大学工程研究生院分子生物学实验室，日本横滨市宝塚台，Hodogaya-ku 240-8501
在这里，我们介绍了一种基于细胞外囊泡（EV）的简单快速的膜型免疫球蛋白定向杂交瘤筛选（MIHS）平台，该平台能够高效分离识别跨膜蛋白三维构象的单克隆抗体（mAbs）。跨膜蛋白是参与信号传导、运输和能量转换的重要膜成分。由于它们以天然构象发挥作用，因此分离识别构象表位的mAbs对于研究和治疗应用都至关重要。然而，传统的检测方法（如酶联免疫吸附测定法ELISA）可能会破坏抗原结构，从而使得这类mAbs的筛选变得困难。为了克服这一限制，我们开发了一种结合MIHS和EV作为抗原呈递工具的筛选策略。EV天然被脂质双层包裹，能够以天然构象展示跨膜蛋白，并且易于分离。作为模型，我们构建了同时表达碱性磷酸酶（ALP）和绿色荧光蛋白的细胞，从而生成能够显示ALP的荧光EV。使用这些EV通过MIHS筛选杂交瘤，随后进行无需直接抗原固定的ELISA检测。所有分离出的mAbs都能识别ALP的构象表位，证明了该方法的结构选择性。这些结果表明，基于EV的MIHS方法为分离具有构象特异性的mAbs提供了一种便捷且结构保真的策略，在基础生物学和抗体开发中具有广泛的应用价值。
部分内容摘录
质粒构建和蛋白质纯化
根据制造商的说明，使用KOD One PCR Master Mix（Toyobo Co., Ltd., 大阪，日本）和In-Fusion HD Cloning Kit（Takara Bio Inc., 滋贺，日本）构建了质粒。所使用的骨架载体为pBApo-CMV Neo（Takara Bio Inc.）。共生成了五种表达质粒：ALP-TM/CMV、GFP/CMV、ALP-TM-GFP/CMV、Full ALP/CMV和InALP-AviHis/CMV（图S1）。插入序列包括分泌信号序列（氨基酸1-19）和膜锚定结构域（氨基酸……）实验概念
在这项研究中，我们旨在开发一种简单的方法来分离针对跨膜蛋白的构象特异性mAbs，并利用模型抗原建立一种新的筛选方法。图1概述了该方法。该系统旨在通过结合EV和MIHS方法来评估杂交瘤中的BCR与结构保持完整的跨膜蛋白之间的相互作用。由于MIHS需要通过FCM进行单细胞水平的结合分析，因此……讨论
已经开发出了多种分离mAbs的方法。无需动物免疫的展示技术可以快速生成抗体，并且最近已被应用于跨膜蛋白的研究（19）。然而，这些技术需要大量的工作来构建和维护多样化的文库，且仍有改进的空间（4）。B细胞克隆技术有助于开发针对传染性疾病的中和抗体（20）；然而，仍存在诸如低 immortalization（永生化率）等挑战……CRediT作者贡献声明
Rina Sakamaki：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始稿，数据管理，概念构思。Takao Matsuba：撰写 – 审稿与编辑，验证。Yasuyuki Kurihara：撰写 – 审稿与编辑，监督，数据管理，概念构思。致谢
本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的特定资助。
