用于微尺度骨模型中纳米尺度力学生物学评估的混合多光子光刻支架

《Small》：Hybrid Multiphoton Lithography Scaffolds for Nanoscale Mechanobiological Assessment in Microscale Bone Models

为了在三维微环境中研究单细胞行为，并克服传统Organ-on-a-Chip (OoC)和生物打印技术分辨率不足的问题，研究人员开发了一种新型混合三维支架。该支架通过多光子光刻(MPL)技术，将合成聚合物(BisSR/CEA)与I型胶原蛋白(Coll-MA)结合，实现了几何结构依赖的单细胞限制和动态重塑。研究发现，支架的生物活性和几何结构，而非刚度，主导了间充质干细胞(MSC)的骨向分化命运。该平台结合了可调谐的微/纳米尺度环境和超分辨成像，为在生理相关三维微环境中研究细胞-基质相互作用提供了新工具，并可与后续OoC系统兼容，对组织工程和再生医学具有重要意义。

　　

在组织工程和再生医学领域，科学家们一直致力于在体外重建和模拟复杂的组织特性。Organ-on-a-Chip (OoC)系统、三维生物打印和类器官培养是当前非常有前景的技术方向。然而，尽管这些技术能够模拟生理条件并构建组织样结构，但它们通常在分辨率和单细胞分析能力上存在局限。这使得研究人员难以在受控的三维微环境中，精准地研究细胞之间以及细胞与支架之间在微米乃至纳米尺度上的相互作用，而这对理解细胞命运决定机制至关重要。此外，骨骼等组织的机械特性具有高度异质性，如何在体外模型中模拟并研究这种力学微环境对细胞（如具有多向分化潜能的间充质干细胞MSC）行为的影响，是另一个重大挑战。为了填补这些空白，一项发表在《Small》期刊上的研究，开发并验证了一个创新的三维混合支架平台，为在单细胞水平上研究力学生物学和骨向分化开辟了新途径。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，核心的制造技术是多光子光刻(MPL)，这是一种高精度增材制造技术，能够实现从纳米到宏观尺度的三维结构加工，特征尺寸可达数百纳米，并允许局部调整材料的力学性能。其次，研究人员设计了两种主要材料：BisSR/CEA（一种由Bis-GMA、SR348C和CEA组成的生物相容性合成聚合物）和甲基丙烯酰化I型胶原蛋白(Coll-MA)，将两者的生物机械特性相结合，构建“硬-软”混合支架。在表征与成像方面，研究运用了原子力显微镜(AFM) 来量化支架的纳米级力学性能（如杨氏模量）；并采用了三维单分子定位显微成像技术(3D SMLM, 如dSTORM) 和共聚焦显微成像，实现了对细胞粘着斑关键蛋白vinculin的超高分辨率三维成像，以及对骨向分化标志物（如胶原蛋白I、骨钙蛋白）的观察。最后，利用人Wharton's Jelly来源的间充质干细胞(MSC) 进行体外培养和成骨分化诱导，以评估支架对细胞行为的影响。

研究结果

2.1 用于单细胞限制和观察的三维混合支架设计

研究人员首先设计了一个受骨结构启发的、体育场状的三维支架。这个外部结构的作用是隔离外部细胞，而其内部则打印了更精密的细胞“笼子”。这些细胞笼子被设计成45 × 45 × 24 μm³的网格结构，笼子的栅栏由硬质材料(BisSR/CEA)或软质生物活性材料(Coll-MA)构成，后者构成了“混合”笼子。设计上留有1微米的缝隙，以允许有限的细胞间通讯，同时确保细胞主要与所有三维壁面相互作用。实验证明，该设计能够可靠地将单个细胞限制在笼子内（约90%的笼子只有一个细胞），为在三维环境中进行单细胞分析提供了基础。通过共聚焦成像（如图1c所示）可以清晰地看到细胞在笼子内的生长状态，其细胞核、肌动蛋白细胞骨架和vinculin蛋白的分布。

2.2 胶原基结构的功能和机械性能

研究的核心之一是验证和调控支架材料的性能。通过AFM纳米压痕实验，研究人员量化了不同材料的杨氏模量(YM)：硬质BisSR/CEA的YM为81 ± 10 MPa，而纯Coll-MA的YM仅为49 ± 32 kPa，呈现凝胶特性。通过添加5 wt%的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作为交联剂，可将Coll-MA/PEGDA的YM提升约7倍，至368 ± 150 kPa，实现了从千帕到兆帕三个数量级的力学性能可调范围，从而能够模拟从软组织到硬骨的不同组织硬度。更重要的是，利用SMLM技术对打印后的Coll-MA线条进行免疫标记成像（如图2b所示），证明了胶原蛋白在制造后仍保持其生物活性（抗体均匀分布）。SMLM图像显示，Coll-MA线条的宽度（半高宽）仅为243 ± 34 nm，首次证明了胶原基结构能达到亚衍射极限的特征尺寸。

2.3 Vinculin分布作为细胞-基质相互作用的指标

Vinculin是一种关键的细胞骨架-细胞外基质连接蛋白，在细胞力学传感中扮演核心角色。为了探究支架刚度和几何形状对细胞-基质相互作用的影响，研究人员在细胞培养第6天和第11天，通过三维SMLM对MSC中的vinculin进行了超高分辨率成像和定量簇分析。结果显示，vinculin在细胞内形成纳米尺度的簇。一个有趣的发现是，vinculin簇的轴向位置(z_pos)会随时间发生动态迁移：在培养第6天，平均z_pos为基底上方153 ± 99 nm；到第11天，则迁移至510 ± 154 nm（如图3d, e所示）。这种向上迁移可能反映了细胞与支架壁相互作用的变化。然而，通过先进的2CALM（双样本三维定位显微数据比较分析）平台对所有样本的vinculin簇密度分布进行比较后发现，无论是硬质笼子还是混合笼子，也无论是第6天还是第11天，其vinculin簇的分布具有高达73 ± 19%的相似性（如图3f所示）。这表明，在研究的早期阶段，vinculin的纳米级组织模式并不依赖于支架的组成（硬质或混合）。

2.4 三维支架对MSC成骨分化的影响

最后，研究评估了该支架平台在引导干细胞命运方面的能力。在成骨诱导培养基中培养21天后，通过免疫荧光染色观察早期和晚期成骨标志物。结果显示，在仅由硬质笼子组成的区域，细胞扩展受限，胶原蛋白I和晚期标志物骨钙蛋白的表达较弱，且主要集中在基底附近。然而，在含有可降解Coll-MA的混合笼子区域，情况截然不同。细胞在降解掉Coll-MA栅栏后，能够沿着剩余的硬质支架结构在三维空间扩展。相应地，这些细胞表现出更强的成骨分化倾向：胶原蛋白I的表达强度相比硬质笼子区域增加了约一倍，并且骨钙蛋白的表达遍布整个支架高度（如图4a, c, e所示）。

研究结论与讨论

该研究成功构建了一个用于器官芯片(OoC)应用的模块化三维组织支架平台。该平台的创新性在于首次将胶原蛋白I与生物相容性合成聚合物通过MPL技术集成，制造出具有纳米级特征尺寸、力学性能可调和动态生物降解特性的三维混合支架。研究最重要的发现之一是，支架的生物活性和几何结构，而非整体刚度，是主导间充质干细胞(MSC)骨向分化的关键因素。在可降解的混合笼子中，细胞通过重塑局部微环境（降解Coll-MA）实现了三维扩展，并显著增强了成骨标志物的表达。

研究还利用三维SMLM对细胞力学传感的关键蛋白vinculin进行了前所未有的单分子水平分析。尽管观察到了vinculin簇随时间的轴向迁移，但其纳米级组织模式在硬质和混合笼子中高度相似，并且与成骨分化程度并未显示出明确关联。这揭示了三维限制模型与二维模型的区别：在三维环境中，vinculin依赖的力学传感通路与最终的分化命运之间存在“解耦”现象。成骨分化可能通过vinculin非依赖的途径（如talin或YAP/TAZ信号）被触发，这凸显了骨向分化机制的复杂性，它受到机械和生化线索（如ECM组成、细胞密度、支架结构和时机）的精细调控。

该工作标志着几个“首次”：首次实现了BisSR/CEA-Coll-MA混合支架与可降解限制；首次设计了具有1微米功能隔离缝隙的单细胞笼；以及首次在MPL打印的可降解三维支架中，对粘着斑动力学进行了三维SMLM量化。总之，这项研究不仅为在生理相关的三维微环境中，以单细胞和单分子分辨率研究细胞-基质相互作用和力学传导机制提供了强大工具，也为未来构建更复杂的、用于骨病建模或骨-软骨接口研究的器官芯片平台奠定了坚实的基础。通过MPL对生物活性蛋白质材料进行三维结构化，为实现对支架几何形状、化学和力学的空前控制开辟了道路，为力学生物学和再生医学研究带来了新的机遇。