《Materials Today》：Membrane-fusogenic polyamidoamines mediate ultralow-dose mRNA transfection through direct cytosolic delivery
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mRNA疗法通过新型聚酰胺胺纳米载体实现高效低剂量递送，突破细胞膜屏障和溶酶体限制，在免疫细胞和健康细胞中均展现出0.1-0.2pg/cell的极低剂量效果，并成功应用于胰腺癌特异性治疗。
赵晓菲|任琼哲|王欣|王思宇|徐聪聪|钟志远|邓超
生物医学聚合物实验室，江苏先进功能聚合物材料重点实验室，化学、化学工程与材料科学学院，辐射医学与防护国家重点实验室，苏州大学，中国苏州215123
摘要
mRNA疗法是一种治疗多种疾病的革命性策略，但其疗效和临床转化在实现高效细胞质mRNA递送方面面临关键挑战。本文报道了一种能够通过膜融合将mRNA直接递送到细胞质的聚酰胺胺（PAA_mef），从而实现高效mRNA转染。PAA_mef通过Ugi四组分反应合成，将其包装成类似病毒的纳米颗粒，这些颗粒通过膜融合进入细胞质，并通过还原触发的聚合物降解快速释放mRNA。这种独特的转运途径使得PAA_mef在极低剂量（0.1–0.2 pg mRNA/细胞）下对多种细胞类型（包括难以转染的免疫细胞）具有出色的转染效率，与病毒载体的效果相当。腹腔注射mRNA-Luc@PAA_mef（剂量为0.25 μg mRNA/小鼠）可实现对胰腺的特异性转染，选择性高达90%，并通过递送IL-12 mRNA有效抑制原位KPC胰腺肿瘤。PAA_mef的直接细胞质mRNA递送为mRNA疗法开辟了新的前景。
引言
mRNA疗法是疾病预防和治疗的革命性策略，但其疗效和临床转化在实现高效细胞质mRNA递送方面面临关键挑战，主要是由于细胞外和细胞内的多种障碍[1]、[2]、[3]、[4]。开发具有更高安全性和效率的递送系统是实现mRNA疗法潜力的重要前提[5]、[6]、[7]。虽然病毒载体具有优异的转染能力，但其临床应用受到显著的免疫原性风险、潜在的基因组整合危害以及复杂制造过程的限制[8]、[9]。非病毒载体作为更安全、更可扩展的解决方案，具有更好的生物相容性和较低的免疫风险[10]、[11]、[12]、[13]，但目前的非病毒递送平台在转染效率、生理环境中的稳定性、内体逃逸效率以及细胞内释放效果方面仍存在局限性[14]、[15]、[16]。
非病毒递送系统主要依赖内体途径进入细胞，但即使是最先进的脂质纳米颗粒（LNPs），也只有1–4%的RNA载荷能够进入细胞质[16]、[17]、[18]、[19]。为了提高内体逃逸效率，通常需要高剂量的递送剂来诱导内体破裂，这反而增加了毒性风险并降低了治疗效果[20]、[21]、[22]。此外，内体破裂通常会通过与内体膜上的糖结合激活细胞质半乳凝集素，从而引发不良副作用[23]、[24]。因此，迫切需要设计出能够实现高效低剂量细胞质递送的mRNA载体，以推进临床应用。
在本研究中，我们设计了一类能够在极低剂量下有效转染mRNA的聚酰胺胺（PAAs）（图1）。PAAs通过Ugi四组分反应合成，该反应条件温和、合成通量高，并能同时引入多种功能基团（可离子化胺基、脂质、二硫键等），便于全面研究结构与递送之间的关系。表现最佳的PAA（P1114）可通过膜融合与细胞膜相互作用，并直接将mRNA递送到细胞质。我们假设优化的PAA（PAA_mef）通过三阶段过程实现膜融合驱动的细胞质mRNA递送：（i）带正电荷的mRNA@PAA_mef纳米复合物快速静电吸附到细胞膜上；（ii）纳米复合物与细胞膜发生脂质介导的融合；（iii）谷胱甘肽触发mRNA在细胞质中的释放。mRNA@PAA_mef纳米复合物在极低剂量（0.1–0.2 pg mRNA/细胞）下对多种细胞类型（免疫细胞、癌细胞和健康细胞）表现出出色的转染效果，其效率与病毒载体相当，并且在含80%血清的培养基中仍能保持疗效。腹腔注射mRNA@PAA_mef（剂量为0.25 μg mRNA/小鼠）可实现对胰腺的高效转染，选择性高达90%，并通过递送IL-12 mRNA有效抑制原位KPC胰腺癌。
PAAs用于mRNA递送的合理设计与筛选
Ugi多组分反应是一种非常通用的反应，在聚合物和脂质的合成中得到了广泛应用[25]、[26]、[27]、[28]。我们通过温和条件下的单锅Ugi四组分反应合成了一个聚酰胺胺（PAAs）组合库（称为PABCD）。通过系统地改变2种不同的二羧酸（A）、3种不同的异氰酸酯（B）、5种不同的二胺（C）和5种不同的脂肪醛（D），我们合成了
讨论
COVID-19 mRNA疫苗的批准极大地加速了mRNA疗法的发展，mRNA疗法已被越来越多地用于治疗多种疾病[1]、[2]、[3]。mRNA药物的临床应用仍很大程度上依赖于有效递送系统的创新，基于LNPs或阳离子聚合物的非病毒载体尤其受到关注[5]。然而，在细胞内化后，大多数纳米颗粒容易被
结论
总之，我们通过Ugi四组分反应建立了一个结构多样的聚酰胺胺库，用于mRNA递送，为系统合成和结构优化提供了一个高效平台。结构-活性关系研究表明，脂肪链长度和三级胺在调控细胞质mRNA递送机制中起着关键作用。通过全面筛选，我们发现了具有膜融合能力的P1114聚合物，它能够实现直接
CRediT作者贡献声明
赵晓菲：撰写原始稿件、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。任琼哲：撰写原始稿件、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。王欣：方法学设计、实验研究。王思宇：方法学设计、实验研究。徐聪聪：方法学设计、实验研究。钟志远：撰写、审稿与编辑、项目管理、数据分析、概念构思。邓超：撰写、审稿与编辑、监督，
伦理批准与参与同意
所有动物实验均获得了苏州大学（中国）动物护理与使用委员会的批准，所有实验方案均符合《实验动物护理与使用指南》的要求。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（52373299）和国家重点研发计划（2022YFB3804600）的支持。
