《Toxicon》：Investigating Challenges in Handling, Stability and Recovery of Prymnesins
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研究普里梅尼藻毒素的稳定性和回收率，发现溶剂组成（需70%甲醇以上）、pH值（弱酸性至弱碱性）、干燥状态及固相萃取树脂类型显著影响其性质，为后续提取和分析提供依据。
伊丽莎白·M·马奇（Elizabeth M. Mudge）、莉丝·德梅斯特（Lise De Meyst）、杰克·吉利斯（Jack Gillies）、英格恩·A·萨姆达尔（Ingunn A. Samdal）、皮尔斯·麦卡伦（Pearse McCarron）、克里斯托弗·O·迈尔斯（Christopher O. Miles）
加拿大国家研究委员会计量研究中心（Metrology Research Centre, National Research Council of Canada），地址：1411 Oxford Street, Halifax, NS, B3H 3Z1, 加拿大
摘要
Prymnesium parvum是一种全球分布的触手藻类，能够产生一系列被称为prymnesins的鱼类毒素化合物。Prymnesins是一类大型聚醚，分子量在1600至2300 Da之间。初步研究在开发prymnesins参考材料时发现了回收率和稳定性方面的显著问题。通过一系列系统研究，探讨了溶剂组成、pH值、蒸发至干燥状态以及固相萃取（SPE）树脂对prymnesins稳定性和回收率的影响。实验分别检测了A型和B型prymnesins，以验证观察到的行为是否具有类型特异性。结果表明，使用不同的条件会对prymnesins的稳定性、溶解度和回收率产生显著影响。在含有至少70%有机溶剂（甲醇）的溶剂中，prymnesins在微酸性到弱碱性条件下是可溶且稳定的；然而，prymnesins在乙腈中不溶，并且在丙酮中会形成亚胺衍生物。干燥储存时prymnesins会不稳定，存在随时间递减的损失现象。此外，SPE树脂的类型和实验方案的设计对prymnesins的回收率也有显著影响。这些发现突显了影响prymnesins回收率的多种因素，有助于改进提取程序和分离效率，在进行prymnesins的毒理学或生物活性研究时应予以考虑。
引言
Prymnesium parvum是一种生长在咸水和河口水域中的触手藻类。该物种在全球范围内广泛分布，并曾多次引发大规模鱼类死亡事件（Macêdo等人，2023年；Manning和La Claire，2010年；Southard等人，2010年）。P. parvum适应性强且生长迅速，会对水生生态系统造成严重破坏，例如2022年夏季德国和波兰的奥德河（Oder River）发生的藻华事件（Free等人，2023年；Kolada，2022年）。那次藻华导致整个河流中的鱼类和淡水软体动物数量大幅下降（Free等人，2023年；Kolada，2022年）。这是该地区首次记录到由P. parvum>藻华引发的鱼类死亡事件，估计有360吨鱼类死亡，其中包括受保护的物种（Kolada，2022年）。除了破坏生态系统外，P. parvum>还会对渔业造成重大损失，如挪威的情况（Johnsen等人，2010年；Kaartvedt等人，1991年）。
P. parvum会产生一类名为prymnesins的鱼类毒素（Igarashi等人，1998年；Igarashi等人，1996年）。这些毒素属于大型聚醚，根据其骨架结构被分为A型、B型和C型（Binzer等人，2019年；Igarashi等人，1999年；Rasmussen等人，2016年）。其中两种A型prymnesins，prymnesin-1（PRM-1）和prymnesin-2（PRM-2），其结构已得到明确（Igarashi等人，1999年）。它们的非糖苷骨架含有91个碳原子以及多种官能团，包括共轭二烯和三烯、伯胺、氯基和糖基（图1）。两种B型prymnesins，prymnesin-B1（PRM-B1）和prymnesin-B2（PRM-B2）的结构也已被阐明（图1）（Rasmussen等人，2016年）。它们的非糖苷骨架含有85个碳原子，且缺乏A型中的H–I键合醚环，取而代之的是一个短的三碳链。B型prymnesins中的氯基数量始终低于A型（Binzer等人，2019年）。C型prymnesins的骨架结构尚未被阐明。在P. parvum的不同菌株中检测到了多种这类化合物的类似物（Binzer等人，2019年），并且其组成随培养基成分和生长阶段的不同而变化（Bannon等人，2024年；P?chhacker等人，2025年；Ryderheim等人，2025年；Svenssen等人，2019年）。已有报道指出，P. parvum存在三个不同的化学类型谱系，每个谱系仅产生一种类型的prymnesin（A型、B型或C型）。
在prymnesins的分析、定量和监测中，一个关键问题是缺乏用于定性或定量测量的参考材料。环境样品和P. parvum培养提取物中prymnesin类似物的鉴定通常通过LC–高分辨率质谱（LC–HRMS）或与已知产生prymnesins的P. parvum菌株进行比较来完成（Binzer等人，2019年；Sobieraj和Metelski，2023年）。定量分析依赖于相对响应值，或者使用缺乏对单个prymnesin类似物特异性的间接定量方法，或者使用内部制备的参考材料（Bannon等人，2024年；La Claire等人，2015年；Mazur-Marzec等人，2025年；P?chhacker等人，2025年；Ryderheim等人，2025年；Svenssen等人，2019年）。不同研究和实验室之间提取程序的差异也是prymnesins测量的一个限制因素。为了进行结构鉴定，需要数百升的培养液，但只能获得少量的纯化prymnesins（1–15毫克）（Igarashi等人，1999年；Rasmussen等人，2016年）。在分离A型prymnesins的过程中，使用反相树脂前需要用EDTA冲洗（Igarashi等人，1999年），这表明EDTA冲洗去除了树脂中的杂质，从而提高了prymnesins的回收率。
我们实验室的初步研究表明，存在一些影响prymnesins回收率的因素，但这些因素尚未被广泛报道。更好地理解prymnesins的行为对于提高分离效率、定量精度和毒理学评估至关重要。本文报告了几项关于prymnesins处理、稳定性和回收率的研究结果，这些成果有助于改进prymnesins的分离、分析、定量和毒理学评估方法。
试剂
LC–MS级别的乙腈和甲醇由Fisher Scientific和Carlo Erba（加拿大安大略省渥太华市；意大利科纳雷多市）提供。醋酸和甲酸也来自Fisher Scientific。试剂级别的磷酸二钠、磷酸二氢钾、碳酸氢铵、氯化钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、柠檬酸、丙酮、无水碳酸钠、异丙醇、EDTA二钠以及人工海盐由Millipore–Sigma（加拿大安大略省奥克维尔市）提供。
培养物中的prymnesins谱型
P. parvum UTEX-2797是一种产生A型prymnesins的菌株，在10 psu和32 psu的L1培养基中生长，其prymnesins谱型之前已有描述（Bannon等人，2024年）。10 psu培养提取物中含有两种主要的prymnesins类似物，分别为PRM-1和PRM-2（图1），可表示为PRM-A（3个氯原子）+ 2个戊糖 + 1个己糖；32 psu培养提取物中含有四种主要的prymnesins类似物，其中包括10 psu培养提取物中发现的两种。
CRediT作者贡献声明
皮尔斯·麦卡伦（Pearse McCarron）：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集。英格恩·A·萨姆达尔（Ingunn A. Samdal）：撰写、审稿与编辑、监督、方法学研究、资金筹集、概念构思。杰克·吉利斯（Jack Gillies）：数据可视化、方法学研究、实验设计。莉丝·德梅斯特（Lise De Meyst）：数据可视化、方法学研究、实验设计。克里斯托弗·O·迈尔斯（Christopher O. Miles）：撰写、审稿与编辑、监督、方法学研究、概念构思。伊丽莎白·M·马奇（Elizabeth M Mudge）：撰写、审稿与编辑、原始内容撰写
伦理声明
作者声明本手稿符合Elsevier期刊出版的伦理准则。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据获取
本研究的所有数据均包含在文章和补充信息中。
资助
本研究是在挪威研究委员会（Research Council of Norway）资助的ToxANoWa项目（项目编号：314861）下进行的。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Cheryl Rafuse和Mathias Fon为这些研究提供了藻类的培养和采集工作。
