用于抗蛇毒血清开发的人源化合成纳米体库

《Toxicon》：Humanized synthetic nanobody library for antivenom development

人类化合成纳米抗体库的构建及抗蛇毒活性验证。通过整合8个子库（含4个人类IgG框架与骆驼CDRs），获得高多样性库（1.8×10^8 CFU/mL）。以蛇毒PLA2的Asp49-41多肽为靶标，经四轮噬菌体展示筛选，最终鉴定出4个强抑制活性纳米抗体。该库为开发广谱抗蛇毒疗法提供新工具。

　　

英佳|弗朗西斯科·科罗纳多|凯西·加西亚

德克萨斯大学里奥格兰德河谷分校综合生物与化学科学学院，布朗斯维尔，德克萨斯州，78520，美国

摘要

由于具有高特异性、小尺寸、优异的组织穿透能力和较低的免疫原性，人源化合成纳米体在生物医学研究和治疗性抗体开发中变得越来越重要。在这项研究中，我们通过组合八个子库构建了一个人源化合成纳米体库。每个子库包含四个来自人免疫球蛋白框架序列的框架区域，而互补决定区域（CDRs）则基于骆驼科纳米体序列设计。最终得到的组合库的滴度达到1.8×10^8 CFU/mL，其中大约80%的克隆含有正确的插入片段。为了评估该库的功能，我们合成了一种模拟蛇（Crotalus atrox）毒液中Asp49磷脂酶A2（PLA2）酶活性区域的15个氨基酸长的合成肽（Asp49-41），并将其用作目标抗原。进行了四轮噬菌体展示生物筛选，随后对1344个筛选出的克隆进行了噬菌体酶联免疫吸附测定（ELISA）分析。这次筛选发现了80个阳性克隆，从中选择了30个表现出更强结合信号的克隆进行进一步的ELISA分析，最终确定了16个高亲和力克隆。进一步评估了这四个具有最强结合能力的克隆抑制Asp49 PLA2酶活性的能力，所有四个纳米体均显示出抑制效果。该纳米体库在生物医学研究和治疗性抗毒血清开发方面具有显著潜力。

引言

蛇咬伤中毒仍然是一个严重的全球健康问题，世界卫生组织（WHO）在2017年将其列为最高优先级的被忽视的热带疾病（NTD）（Editorial, 2017; Chippaux, 2017）。据估计，全球每年有540万人被蛇咬伤，其中180万到270万人出现中毒症状。大约有81,410至137,880人因此死亡，30万至40万人留下永久性残疾（WHO, 2023; Afroz et al., 2024）。蛇咬伤中毒已成为WHO列出的20种被忽视的热带疾病中最致命的疾病之一（Munshi and Gajbhiye, 2024）。蛇咬伤中毒主要影响世界上最边缘化的人群，特别是在非洲、亚洲和南美的农村地区（Kasturiratne et al., 2008; Longbottom et al., 2018）。悲剧的是，由于蛇咬伤中毒而失去的寿命在最脆弱的人群中更为常见，即女性（76.7%）和儿童（60.3%）（Basnyat and Shilpakar, 2022; Martins et al., 2022）。此外，残疾调整生命年估计中还包括的心理影响（与蛇咬伤中毒相关的压力、噩梦和恐惧症）是重要的创伤经历，但这些在蛇咬伤中毒研究中往往没有得到量化（Waiddyanatha et al., 2019; Martins et al., 2022）。蛇咬伤还会导致生计损失，包括家畜的死亡（Bolon et al., 2019; Basnyat and Shilpakar, 2022）。蛇毒的病理生理学非常复杂，包含多种毒素，主要包括磷脂酶A2、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和三指毒素，这些毒素会引起从局部组织损伤到全身神经毒性、血液毒性和细胞毒性的各种临床效应（Casewell et al., 2013, 2020; Tasoulis and Isbister, 2017; Cabral-Pacheco et al., 2020; Hall et al., 2023; Bittenbinder et al., 2024）。目前的抗毒血清疗法主要来源于超免疫动物血清，自19世纪末以来一直是治疗的基石。然而，这些疗法存在显著局限性，包括高昂的生产成本、批次间差异、对不同毒液类型的交叉反应有限，以及过敏反应和血清病的风险（Gutiérrez et al., 2011; León et al., 2013; Khalek et al., 2024; Editorial, 2024; Glanville et al., 2025）。幸运的是，针对蛇毒的中和抗体的研究已显著转向重组人单克隆抗体和纳米体，以替代传统的动物来源抗毒血清。这些“下一代”疗法旨在提高安全性，减少过敏反应，并提供对多种物种的“广谱”覆盖。当前在“下一代”抗毒血清开发方面的进展包括：1）广谱中和人抗体（Glanville et al., 2025; Damsbo et al., 2025）；2）广谱纳米体混合物（Ahmadi et al., 2025）；3）针对三指毒素的人工智能设计蛋白（Vázquez-Torres, S. et al., 2025）。

纳米体（Nbs）最初被描述为重链抗体的可变重链结构域（VHHs），源自骆驼科仅重链抗体（HCAbs）的可变（V）结构域，代表了生物治疗领域的重大进步（Hamers-Casterman et al., 1993; Muyldermans, 2013; Bannas et al., 2017）。纳米体的分子量约为12-15 kDa，远小于传统抗体（约150 kDa），具有组织穿透能力强、溶解度高、热稳定性好、易于人源化以及免疫原性低等优点（Huang et al., 2010; Muyldermans, 2013; Scully et al., 2019; Jov?evska and Muyldermans, 2020; Xu et al., 2021; Alexander and Leong, 2024）。它们简单的结构由一个可变结构域组成，能够实现对目标抗原的高结合亲和力和特异性，使其成为中和复杂生物分子（如动物毒液）的理想候选者。此外，VHHs可以识别传统抗体难以识别的表位（Muyldermans, 2021），纳米体还可以通过工程改造增强功能，例如多价性或双特异性，从而同时靶向多种毒液成分（Chanier and Chames, 2019; Huo et al., 2020; Yang and Shah, 2020; Zupancic et al., 2021; Wang et al., 2022; Swart et al., 2025）。这些特性使纳米体成为开发具有更好安全性、有效性和可及性的下一代抗毒血清的有希望的平台，相比传统的基于血清的疗法。此外，合成纳米体库的发展通过体外多样化纳米体框架的互补决定区域（CDRs）生成了大量的序列库（通常超过10^9个变体），可以使用噬菌体或酵母展示等技术针对任何目标进行筛选（Moutel et al., 2016; Zimmermann et al., 2018; McMahon et al., 2018）。与免疫来源的库不同，合成库可以更好地控制多样性，减少与动物使用相关的伦理问题，并能够快速识别针对特定毒液的纳米体（Zimmermann et al., 2018; Muyldermans, 2021; Alexander and Leong, 2024）。

纳米体的人源化是确保其在人类治疗中的安全性和有效性的关键步骤。这一过程涉及将骆驼科纳米体的CDRs移植到人抗体框架上或修改表面残基，同时保持抗原结合亲和力（Vincke et al., 2009; Moutel et al., 2016; Li et al., 2023; Fridy et al., 2024）。通过引入人源化框架，这些抗体降低了免疫原性风险，增强了临床应用的潜力。计算蛋白质设计和结构生物学的进步促进了具有优化药代动力学特征和降低抗药物抗体（ADA）反应风险的人源化纳米体支架的发展（Sang et al., 2022; Gordon et al., 2024; Ramon et al., 2024）。对于抗毒血清应用而言，人源化纳米体必须保持对毒液毒素的高亲和力结合，在生理条件和中毒组织的恶劣生化环境中表现出稳定性（Khalek et al., 2024; Benard-Valle et al., 2024）。将人源化合成纳米体库整合到抗毒血清开发流程中，提供了一种可扩展且成本效益高的方法，以生产具有更好安全性和更广泛治疗覆盖范围的治疗药物。

本研究旨在生成一个人源化合成纳米体库，用于开发能够中和多种蛇毒毒素的抗毒血清。通过高通量筛选和定向功能测定，我们寻求识别具有高结合亲和力和强中和能力的纳米体。这项工作的重要性在于它有可能解决当前抗毒血清疗法的局限性，为蛇咬伤中毒提供更安全、更有效和普遍可获得的治疗方法。通过推进基于纳米体的治疗领域，本研究有助于减少与蛇咬伤相关的全球发病率和死亡率，特别是在资源有限的地方，那里获取传统抗毒血清仍然是一个挑战。

部分摘录

人源化合成纳米体库

为了生成一个人源化合成纳米体库，我们使用了人免疫球蛋白重链可变区域DP-47框架（PDB: 8RP8）。互补决定区域（CDRs）的氨基酸长度是根据从骆驼科纳米体CabbcII10（PDB: 1ZMY）的多个序列比对中识别出的保守残基设计的，作为在Protein Data Bank（PDB）中进行BLAST搜索的查询序列。2025年1月，总共

人源化合成纳米体库

为了生成能够靶向多种抗原（包括毒液毒素）的人源化合成纳米体库，我们将骆驼科纳米体（CabbcII10）的三个CDRs移植到人IgG重链框架（DP-47）上，替换了相应的人源CDRs。对公共数据库中的骆驼科VHH序列的分析显示，最常见的CDR1长度为10个氨基酸，而CDR2主要包含16或17个氨基酸。相比之下，CDR3的长度变化更大，

讨论

纳米体（Nbs）最初被称为重链抗体的可变重链结构域（VHHs），源自骆驼科仅重链抗体（HCAbs）的可变（V）结构域。这些天然存在的纳米体具有独特的性质，使其非常适合多种应用，包括其小尺寸、易于基因操作、高亲和力和溶解性、整体稳定性、耐受恶劣条件（例如低pH值、高温）以及低

结论

在这项研究中，我们通过将人IgG框架与骆驼科VHH CDRs结合，成功构建了一个人源化合成纳米体库。所得库具有高多样性，滴度为1.8×10^8 CFU/mL，大约90%的克隆含有预期长度的插入片段。通过四轮噬菌体展示生物筛选，我们识别出许多对Asp49 PLA2肽具有特异性结合亲和力的纳米体。为了进一步证明纳米体的功能性，我们

伦理声明

本手稿报告了尚未发表且未被其他地方考虑发表的原创工作。所有作者均已批准提交发表，所有有权署名的作者均已列出。所有作者都已审阅并同意提交的稿件版本。

伦理声明

代表所有作者并获得他们的许可，我声明：

(a)

该材料尚未在其他地方全部或部分发表。

(b)

该论文目前未被其他地方考虑发表。

(c)

所有作者都亲自并积极参与了导致该报告的实质性工作，并将对其内容共同和个人负责。

资助

这项研究得到了德克萨斯大学里奥格兰德河谷分校综合生物与化学科学学院的内部资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家神经疾病和中风研究所（NIH–NINDS）的资助，资助编号为R15NS128563。

CRediT作者贡献声明

英佳：概念化、数据管理、正式分析、资金获取、研究、方法学、资源提供、监督、初稿撰写、审稿与编辑。弗朗西斯科·科罗纳多：概念化、研究、审稿与编辑。凯西·加西亚：概念化、研究、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本手稿所述工作的财务利益或个人关系。