在拟态弧菌（Vibrio mimicus）中，与溶血素相关的TH基因位点能够重新编程细胞的中心代谢过程，并通过铁元素的获取将其与抗氧化应激防御机制相结合，从而增强该菌的毒力

《Aquaculture》：The hemolysin-associated TH locus in Vibrio mimicus reprograms central metabolism and couples it to oxidative stress defense through iron acquisition to drive virulence

构建Vibrio mimicus ΔTH及补全株，发现ΔTH株溶血活性显著降低且致病性减弱（LD50提高4倍），补全株部分恢复。转录组分析揭示TH缺失导致TCA循环及氧化磷酸化下调，碳水代谢等上调，引发铁缺乏，细菌转向防御性表型（失趋化、拟生物膜适应），并降低宿主炎症反应。证实TH位点通过铁代谢调控核心代谢与氧化应激，是致病关键上游调控因子。

　　

王娇|彭坤|王一琳|周可宇|林静怡|欧阳萍|黄晓莉|陈德芳|耿毅

四川农业大学水产学院，中国成都611130

摘要

溶血素是许多细菌病原体的关键毒力因子，它能够破坏宿主细胞膜，诱导细胞裂解，并在感染过程中帮助病原体逃避免疫系统。Vibrio mimicus是一种流行性病原体，对水生动物和人类健康构成威胁，其特征是感染鱼类后发病迅速且死亡率较高。目前，V. mimicus中与溶血素相关的TH基因座的功能和机制仍不清楚。在本研究中，我们构建了V. mimicus的TH基因座缺失株（ΔTH）和互补株（ΔTH::TH）。缺失的TH基因座包含两个相邻的溶血素相关基因VM17590和VM17595。我们发现ΔTH株几乎完全丧失了溶血活性，其体内毒力显著减弱，LD₅₀从野生型株的4.75×10³ CFU/mL增加到ΔTH株的1.89×10⁵ CFU/mL，而ΔTH::TH株的毒力部分恢复到2.13×10⁴ CFU/mL。TH基因座的缺失严重影响了细菌利用三价铁的能力，导致细菌处于铁饥饿状态，进而重新编程了其代谢途径。TH基因座缺失后，转录组分析显示有1409个基因表达发生变化，其中639个基因上调，770个基因下调，铁依赖性的TCA循环和氧化磷酸化过程显著下调，同时碳水化合物代谢、翻译和大分子生物合成过程上调，表明细菌发生了以生存为导向的代谢转变。这种代谢紊乱导致细菌对氧化应激过度敏感，并触发其生活方式从侵袭性、移动状态转变为防御性、静止状态，表现为趋化性丧失以及与生物膜形成相关的基因表达变化。从功能和表型上看，这种转变导致细菌在体内的毒力显著减弱，并调节了宿主的炎症细胞因子反应。我们的研究结果表明，TH基因座是V. mimicus毒力的关键上游调控因子，它将环境中的营养获取与代谢完整性紧密联系起来。

引言

Vibrio mimicus广泛分布于水生环境中，是影响水生动物和人类的重要病原体（Tian等人，2024年；Yu等人，2017年）。在水产养殖中，V. mimicus与多次弧菌病爆发有关，导致包括Pelteobagrus fulvidraco（黄鲶）、Silurus soldatovi（南方鲶）和Ictalurus punctatus（沟鲶）在内的经济价值较高的淡水鱼类大量死亡（Feng等人，2023年；Geng等人，2014年；Peng等人，2025年）。在人类中，V. mimicus可引起多种临床表现，如胃肠炎、伤口感染和败血症（Qin等人，2023年）。尽管对其致病性越来越关注，但其毒力调控的分子机制仍不完全清楚。

溶血素是一类由多种病原微生物产生的孔形成毒素（Tweten，2005年；Ulhuq和Mariano，2022年）。在V. mimicus中，溶血素长期以来被认为是一个重要的致病因子，但其确切的生物学作用尚不明确。溶血素通过裂解宿主红细胞释放血红蛋白中的铁，为病原体提供了丰富的铁来源（Kavianpour等人，2024年；Wang等人，2026年）。除了破坏细胞膜外，溶血素还有助于病原体逃避免疫系统并增加全身毒性（Hu等人，2021年；Wang等人，2026年）。最新研究表明，溶血素介导的铁获取不仅限于营养物质的获取，还影响细菌的整体生理过程，包括铁响应的代谢网络和应激适应途径（Murdoch和Skaar，2022年；Porcheron和Dozois，2015年；Wang等人，2026年）。值得注意的是，溶血素的表达通常受铁浓度的调节，并整合到铁调控回路中。溶血素的产生受到铁可用性和铁吸收调节因子Fur的调控，同时还与其他毒力因子协同作用（Gao等人，2018年；Stoebner和Payne，1988年）。因此，溶血素的作用不仅限于作为宿主铁的吸收因子，还可能与细胞内的铁状态密切相关，并可能参与铁相关的生理重塑和应激适应（Porcheron和Dozois，2015年）。

铁对细菌生长和毒力至关重要，因为它作为许多参与DNA合成、三羧酸（TCA）循环、呼吸作用和氧化应激防御的酶的辅因子（Andrews等人，2003年；Gonciarz和Renslo，2021年；Puig等人，2017年）。铁缺乏会损害能量代谢，并触发有利于细菌在营养受限条件下生存的全局代谢调整（Massé和Arguin，2005年；Porcheron和Dozois，2015年）。然而，细胞内铁水平异常升高会促进大量活性氧（ROS）的生成，这些活性氧来源于铁催化的Haber-Weiss循环中的芬顿反应，从而加剧细胞大分子的氧化损伤（Chen等人，2021年；Cornelis等人，2011年；Huang等人，2025年；Tang等人，2024年）。因此，铁稳态与代谢适应性、氧化应激抵抗能力和最终的毒力密切相关（Bertrand，2017年；Cabantchik，2014年；Zhang等人，2017年）。鉴于溶血素在宿主铁释放中的作用，这些联系表明溶血素可能不仅通过损害宿主细胞，还通过重塑铁依赖的代谢和应激适应机制来影响V. mimicus的致病性。

我们之前在V. mimicus中的研究表明，Fur基因对于维持代谢稳态（尤其是柠檬酸循环和氧化磷酸化）至关重要，并显著影响细菌的运动能力、耐受性和毒力（Peng等人，2025年）。此外，由waaC编码的ADP-庚糖-LPS庚糖基转移酶I对于脂多糖的完整性、代谢稳定性和宿主炎症反应也至关重要（Zhou等人，2025年）。这些发现表明V. mimicus的毒力与代谢调节和环境适应密切相关。此外，铁的获取是Vibrio致病性的前提条件，在V. mimicus中涉及多个系统，包括溶血素、TonB系统和Fur（Yu等人，2019年）。尽管TonB系统和Fe²⁺/Fe³⁺的吸收已被证实与V. mimicus的致病性有关（Cooper等人，2020年；Noinaj等人，2010年），但溶血素在铁获取、代谢重塑、氧化应激防御和毒力中的具体作用仍不清楚。在本研究中，我们通过自然转化构建了V. mimicus的TH基因座（VM17590 - VM17595）缺失株和互补株，并结合转录组分析、铁利用实验、氧化应激挑战、表型鉴定和体内感染模型，证明了TH基因座是一个核心调控中心，它将铁的获取与细菌的核心代谢活动和氧化应激防御联系起来，最终决定了其致病潜力。

细菌菌株和培养条件

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1中。这些菌株在Luria-Bertani（LB）培养基中于28°C、37°C或42°C条件下培养。在ΔTH::TH菌株中，当培养物OD₆₀₀达到0.4–0.6时，通过添加IPTG（MCE?，HY-15921）至最终浓度0.1 mM来诱导TH基因座的表达。

TH基因座缺失株和互补株的构建

TH（VM17590-VM17595溶血素基因座）缺失突变体是通过V. mimicus的自然转化获得的（Yu等人，2019年）。之前的全基因组

TH基因座缺失株和互补株的成功构建

PCR和RT-qPCR用于确认TH基因座缺失株和互补株的有效构建。琼脂糖电泳结果显示，当使用V. mimicus特异性检测引物对VM177-F/R时，所有三个菌株均产生了177 bp大小的片段（图1A）。当使用引物对TH_1-F/R和TH_2-F/R时，在SCCF01菌株和互补株ΔTH::TH中分别检测到了878 bp（TH_1）和976 bp（TH_2）的TH基因片段。

讨论

溶血素长期以来被认为是一种典型的细菌病原体毒力因子，主要因其直接的细胞裂解活性，这种活性有助于营养物质的获取和组织损伤（Chen等人，2017年；Ren等人，2022年；Sanathanan等人，1987年）。在V. mimicus中，我们的研究结果表明，TH基因座是一个关键的上游毒力调控因子，它将依赖溶血作用的铁获取与下游的核心代谢变化、氧化应激耐受性和感染结果联系起来。

结论

V. mimicus中的溶血素相关TH基因座被确认为一个关键的毒力决定因子，其作用超出了传统的细胞裂解作用。它作为致病途径的重要组成部分，将宿主铁的获取与核心代谢（包括TCA循环、氧化磷酸化和抗氧化防御）的完整性联系起来。这种铁-代谢轴支持细菌的侵袭性、移动生活方式，这对实现完全的毒力至关重要。该途径的破坏会迫使细菌

作者贡献声明

王娇：撰写初稿、方法学研究、数据分析。彭坤：方法学研究、实验设计、数据分析。王一琳：方法学研究、实验设计。周可宇：实验设计、数据分析。林静怡：方法学研究、实验设计。欧阳萍：资源获取、项目管理。黄晓莉：方法学研究、概念构思。陈德芳：撰写、审稿与编辑。耿毅：监督、资金争取。

伦理批准

动物实验遵循四川农业大学实验动物管理和动物护理使用委员会的规章制度，并获得了该校的动物实验许可（许可编号20250703）。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号32373174）和四川省农业产业技术创新团队项目（编号SCCXTD-2025-15）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有与本文讨论的主题或材料相关的任何组织或实体的财务或非财务利益关系。