《Aquaculture》：Identification of candidate genes and SNPs associated with high temperature tolerance by genome-wide association study (GWAS) in Urechis unicinctus (Annelida, Echiura)
编辑推荐：
本研究通过全基因组重测序和关联分析，鉴定出17,693,070个高质量SNP，发现209个与高温耐受相关的SNP及318个候选基因，并通过RNAi验证CAD基因的关键作用，为分子辅助育种提供了理论依据。
林大伟|卢颖|张龙|冯旭新|姜文文|张志峰|马宇斌
中国海洋大学三亚海洋研究所，海南省热带水生种质资源重点实验室，三亚 572000，中国
摘要
Urechis unicinctus是一种具有高经济价值的水产养殖物种。由于温度条件的限制，它主要分布在中国渤海和黄海的部分潮间带。此外，夏季的高温常常导致U. unicinctus大量死亡，严重阻碍了其水产养殖业的发展。鉴定与耐热性相关的SNP和候选基因对于培育耐热品种至关重要。本研究采用全基因组重测序技术进行基因分型。经过质量筛选后，获得了17,693,070个高质量SNP用于全基因组关联分析（GWAS）。共鉴定出209个与耐热性相关的SNP和318个候选基因。通过精细定位分析这些SNP并确定其致病变异。在验证群体上进行了Sanger测序以确认基因分型结果。通过整合GWAS和转录组数据，发现六个基因（MYT1、CAD、SMC6、SPG7、KLHL15、HEATR5B）含有与耐热性相关的SNP。进一步研究表明，CAD在耐热性中起关键作用。耐热性的遗传率估计为0.376 ± 0.124，属于中等水平。基因组选择（GS）分析表明，RR-BLUP模型是描述耐热性状的最佳模型。这些发现为理解U. unicinctus的耐热性分子机制提供了理论基础，并为标记辅助选择和培育耐热品种提供了技术支持，从而加速其水产养殖业的可持续发展。
引言
水生动物富含蛋白质、必需氨基酸和重要矿物质等营养成分，是解决营养不良问题的宝贵资源。因此，水产养殖已成为全球增长最快的食品生产领域（Rakkannan和Agarwal，2025）。2022年，全球水生动物养殖产量达到9440万吨的新纪录，首次超过捕捞渔业（占总产量的51%）。预计到2032年，全球水产养殖产量将达到1.11亿吨（FAO，2024）。温度是影响水生动物生存的关键环境因素之一。近年来，全球气候变化导致极端高温事件频繁发生，威胁水生物种的生存并限制了水产养殖业的发展（Barbarossa等，2021；Zhou等，2022；Li等，2024）。
Urechis unicinctus是一种重要的商业底栖无脊椎动物，主要栖息在日本、韩国沿海地区、中国环渤海海域及黄海的部分区域（Li等，1995；Struck等，2011）。作为一种新兴的高价值水产养殖物种，U. unicinctus具有美味的口感和与海黄瓜相当的营养价值。其干重蛋白质含量高达71.01%，远高于贻贝和牡蛎等其他水产品（Sung等，2008）。此外，U. unicinctus含有多种生物活性物质，如肽和多糖，具有降血糖、降压和抗氧化作用（Li等，2022；Kang等，2019）。2022年，它被中华人民共和国农业农村部列为十大重点水生种质资源之一（Zhang等，2025a）。目前U. unicinctus的水产养殖方式主要包括池塘养殖、潮间带泥滩人工养殖和工业化集约化养殖（Xu等，2016；Huang等，2020）。然而，关于高温对U. unicinctus影响的研究相对有限。除了生长和存活的表型研究（Zheng等，2006；Xu等，2017；Zhang等，2020；Ding等，2023）外，其耐热相关基因和机制尚未得到深入研究。U. unicinctus的适宜生存温度范围为8-26°C（Xu等，2017）。近年来，夏季高温导致养殖池塘水温长时间超过30°C，超出了U. unicinctus的适宜生存温度，导致大量死亡（Ding等，2023）。这已成为该物种池塘养殖的主要挑战之一。在夏季高温期间，人工降温措施是确保其生存的唯一方法。此外，耐热性是决定变温动物分布的关键因素（Jiang等，2022；Sunday等，2011）。因此，提高U. unicinctus的耐热性对其安全越冬（夏季存活）和扩大养殖范围至关重要。培育耐热品种对于U. unicinctus的水产养殖业可持续发展至关重要。因此，阐明耐热性的遗传基础并加速其耐热性的遗传改良已成为育种研究的紧迫任务。
这种对高温的敏感性与潮间带生态密切相关。U. unicinctus生活的潮间带在潮汐周期中经历极端的日温差，对栖息生物造成反复的热应力（Helmuth等，2006；Somero，2010）。这种选择压力推动了复杂的生理和分子适应机制的进化，以维持细胞稳态（Tomanek，2010；Dong等，2018）。因此，潮间带无脊椎动物成为研究耐热性的宝贵模型。尽管软体动物和甲壳类的生理反应已得到较好研究，但像U. unicinctus这样的海洋环节动物的耐热性遗传机制仍大多未被探索。鉴于全球变暖对沿海水产养殖的日益威胁，鉴定这种新兴水产养殖物种的耐热关键基因和途径已成为当务之急。阐明这些遗传基础对于预测气候变化影响和实现标记辅助选择耐热品种至关重要。
传统选择育种方法由于种群内个体间耐受性的差异，在遗传改良方面效率低下（Meuwissen等，2001；Blay等，2021；Chi等，2024）。单核苷酸多态性（SNP）标记被认为是GWAS的理想遗传标记，具有分布广泛、密度高和易于识别的特点（Dou等，2025；Huang等，2022）。随着高通量和低成本测序技术的进步，全基因组关联研究（GWAS）已成为识别水生动物复杂经济性状相关遗传变异和基因的强大工具。该方法基于表型与遗传标记之间的统计分析（Houston等，2020；Yue，2014；Cui等，2025）。在水生动物研究中，GWAS已被广泛用于分析生长性状（Ning等，2019；Gutierrez等，2023；Wang等，2023；Sun等，2025；Tai等，2025；Ma等，2025）和抗病性状（Sánchez-Roncancio等，2022；Palti等，2024；Wang等，2024a；Zhang等，2025b；Chang等，2025；Wang等，2025；Sun等，2025a）。尽管在鱼类和软体动物等物种的耐热性研究方面取得了一些进展，但与生长和抗病性相比，这一领域的研究仍较少（Yu等，2021；Wu等，2021；Jiang等，2022；Udayantha等，2023；Chi等，2024；Li等，2024；Wang等，2024b；Liu等，2025a，Liu等，2025b，Liu等，2025c；Liu等，2025a）。通过GWAS，在这些物种中鉴定出了与耐热性相关的SNP和候选基因，为理解耐热机制和培育耐热品种提供了基础。然而，目前尚无关于海洋环节动物耐热性的GWAS分析报告。基因组选择（GS）利用全基因组分子标记来估计基因组估计育种值（GEBV），从而能够准确预测个体育种潜力（Goddard和Hayes，2007）。与传统育种方法相比，GS具有更高的预测准确性、更快的遗传增益、更短的育种周期，且无需系谱记录（Shan等，2021；Zhao等，2021）。随着测序成本的显著降低，GS已在多种水产养殖物种中得到应用（Tsai HsinYuan等，2015；Dong等，2016；Liu等，2019；Chi等，2024）。然而，大多数GS研究集中在生长或抗病性状上，对高温耐受性的研究较少。
像耐热性这样的数量性状的遗传结构通常是多基因的，涉及许多小效应位点（Visscher等，2017；Barghi等，2020）。但在某些情况下，部分遗传变异可归因于具有较大效应的位点，即主要效应数量性状位点（Rockman，2012）。对于水生物种，关于耐热性的研究揭示了这两种情况：一些研究报道了主要效应位点的存在（Li等，2024；Liu等，2025a，Liu等，2025b，Liu等，2025c），而另一些研究则支持高度多基因的结构（Yu等，2021；Wang等，2024b）。鉴于这种复杂性和对U. unicinctus>的先验知识不足，结合GWAS和GS的双重方法尤为合适。GWAS适用于识别具有中等至较大效应的位点，这些位点在全基因组范围内具有显著性，随后可优先进行功能验证。相比之下，GS利用全基因组标记来预测遗传价值，从而在育种计划中做出选择决策（Goddard和Hayes，2007；Houston等，2020）。
本研究利用全基因组重测序获得的SNP进行GWAS，以鉴定U. unicinctus中的高温相关SNP和基因。通过精细定位分析筛选致病SNP变异。通过对45个耐热个体和45个不耐热个体的Sanger测序验证其耐热性关联。进一步通过RNAi验证了与耐热性相关的基因的功能。最后，对U. unicinctus>进行了耐热性的基因组选择。这些结果将有助于阐明U. unicinctus>的耐热性遗传基础，并为培育耐热品种提供分子标记辅助选择，为其水产养殖业的可持续发展奠定坚实基础。
样本收集
实验中使用的U. unicinctus>成体来自中国山东省潍坊附近的沿海地区。根据试验开始前的视觉检查，仅选择外观健康、表面无损伤且对触觉刺激有活跃反应的个体。实验前，将这些蠕虫在充氧海水中（18°C，pH 8.0，盐度30 PSU）驯养三天。
热休克挑战和表型统计
为了评估U. unicinctus的耐温性，选择了五个胁迫温度（26、28、29、30和32°C），以18°C作为对照条件。在实验室培养系统中进行了初步实验，比较了不同的加热速率（1°C/2小时、1°C/小时和2°C/小时）的影响。结果表明，1°C/2小时的加热速率下U. unicinctus>的存活时间比1°C/小时和2°C/小时更长。
讨论
全球变暖导致的海水温度升高正在影响水生动物的生长、存活和产量（Van Wynsberge等，2020；Baag和Mandal，2022；Yu等，2023），这对全球渔业和水产养殖产生了显著影响（Islam等，2022）。特别是近年来，夏季水生动物的大规模死亡事件更加频繁，造成了经济损失（Alfaro等，2019；Chi等，2024；Dou等，2025）。同样，作为一种新兴的高价值
结论
本研究探讨了U. unicinctus在不同温度下的耐热能力，并确定了用于GWAS分析的胁迫温度和表型。通过GWAS分析，共鉴定出209个与耐热性相关的SNP和318个候选基因。精细定位分析显示，chr6:52475116与耐热性的相关性最强，这一结果在独立群体中通过Sanger测序得到了进一步验证。
CRediT作者贡献声明
林大伟：撰写——初稿，可视化，方法学，研究，数据管理。卢颖：撰写——初稿，研究，数据管理。张龙：方法学，研究，数据管理。冯旭新：方法学，研究，数据管理。姜文文：方法学，数据管理。张志峰：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。马宇斌：撰写——审稿与编辑，监督，概念构思。
未引用的参考文献
Endelman, 2011
Gagnière等，2010
Lehmann, 2005
Song等，2022
Wang等，2023a
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了海南省重点研发项目（ZDYF2021XDNY180）的支持。感谢海洋生命科学学院大型仪器共享平台的支持。
