《Flora》：Ecological Adaptation and Genome-Wide Association Study of Phenotypic and Anatomical Variations in Keteleeria Needles
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针叶形态解剖变异及基因组关联分析揭示Keteleeria属12物种的形态分化、环境适应机制及多基因调控网络，GWAS识别1957个显著SNP位点，关联基因富集于生物碱合成、鞘脂代谢等通路，支持传统分类并优化资源保护策略。
袁彦超|王俊辉|张培|郭玉峰|王志勇|刘世荣|贾子瑞
中国林业和草原局森林生态与环境重点实验室，中国科学院林业生态与自然保护研究所，北京100091
摘要
本研究结合了解剖表型研究和基因组学方法，分析了12种Keteleeria属植物针叶的形态和解剖变异、生态适应策略以及遗传调控机制。对17个针叶特征的评估显示，除树脂管（始终为2条）和表皮厚度外，存在显著的种间差异（p < 0.01）；其中表皮厚度（变异系数（CV）=1.151）和栅栏组织厚度（CV=1.167）的变异程度最大。相关性分析表明，某些特征之间存在显著的相关性，例如针叶长度与树脂管面积之间的相关性，以及针叶厚度与中央柱厚度之间的相关性（p < 0.01）。聚类分析和主成分分析将这12个物种分为5组，这在一定程度上支持了传统的地理分类，但也提示应结合分子证据来确认存在争议的物种。环境适应性分析表明，表皮增厚和中央柱膨胀可以提高水分保持能力，从而增强抗旱能力。全基因组关联研究（GWAS）鉴定了1,957个与2,058个候选基因相关的显著SNP位点（-log??P>5）。共有682个基因与表皮厚度相关，这些基因富集在生物碱合成（托品烷类、哌啶类和吡啶类生物碱合成以及异喹啉类生物碱合成）和鞘脂代谢途径中，这些途径对降水量季节性变化有响应。另有469个基因与针叶长度相关，这些基因通过微管细胞骨架组装和染色质重塑来调节无性繁殖和硫胺素代谢，这些过程受温度波动的影响。还有581个基因与栅栏组织厚度相关，它们通过这些机制调节细胞分裂。这些发现为Keteleeria属的系统性分类和保护提供了科学依据，并加深了我们对Keteleeria植物复杂性状在分子水平上的调控机制的理解。
引言
叶片作为具有高度可塑性和易受环境因素影响的器官，其形态和解剖特征既反映了环境因素的影响，也体现了植物在进化过程中的适应过程（Valladares等，2007）。叶片的发育和形成是一个复杂的生理和生化调控过程（Lv等，2023），其结构的变化可能会改变树木的生理功能（Li和Bao，2005）。叶片的形态和解剖结构是树木遗传特性与环境因素共同进化的结果（Ji，2013），它们在不同生境中的变化在一定程度上反映了植物对生境的适应策略（Ni等，2022）。比较研究表明，叶片的形态特征，尤其是大小和形状，在来自不同自然环境的种群中存在适应性差异（Saxe等，2001）。在裸子植物研究中，针叶的表型和解剖特征不仅在物种间存在显著差异（Wu和Hu，1997；Xing等，2014），而且在同一物种的不同地理种群间也存在差异（Buraczyk等，2022；Jankowski等，2017），这些差异与种群所处的生境密切相关（Lukjanova和Mandre，2010）。对于针叶树种来说，叶片的形态和解剖特征既存在明显的变异，也存在内在相关性（Wang，2020）。
全基因组关联研究（GWAS）通过将全基因组范围内的遗传多态性与表型变异进行统计关联，以精确识别复杂性状的遗传结构，已成为发现功能基因的有效方法（Ingvarsson和Street，2010；Korte和Farlow，2013）。该方法的基本原理依赖于连锁不平衡（LD），并利用高通量测序或SNP阵列技术来识别有助于解读表型变异分子机制的高密度遗传标记（Mackay和Powell，2007）。尽管GWAS已成功识别出许多与性状相关的位点，但复杂性状通常由多个基因和基因型-环境相互作用共同调控，这可能导致某些关联中的混淆效应，例如由于上位性或环境因素的影响（Malmberg等，2005）。
Keteleeria是松科中一个原始的残遗属，它从第四纪冰期幸存下来，主要分布在中国（Huang等，2021；Wang等，2012）。它是研究针叶植物起源、进化和植物地理学的关键物种之一（Mathewes等，2016；Ran等，2018）。Keteleeria属的树木是常绿针叶树，是纤维工业的重要木材资源，具有重要的经济价值和科学研究意义。目前关于Keteleeria的研究主要集中在细胞学研究（J. Chen，2007；Li等，2013）、濒危物种的保护（Chen等，2023）、幼苗繁殖（Zhang等，2021）以及地理分布（Ma等，2022；Zuo，1989）方面。然而，关于Keteleeria针叶的解剖特征和生态适应性的研究相对较少。
Keteleeria属物种广泛分布于不同的地理区域。作为其核心功能器官，针叶在形态和解剖特征上表现出变异，这些变异是适应环境条件的关键表现。然而，关于不同Taxus物种间针叶特征变异模式、生态适应机制和遗传调控基础的系统认识仍然不足。为填补这一空白，本研究聚焦于12种Keteleeria物种的针叶，结合了表型解剖学和基因组学方法来探讨针叶形态和解剖特征的内在相关性、变异模式和生态适应性。通过分析候选基因的表观遗传调控机制，我们揭示了Keteleeria环境适应策略的分子基础。本研究旨在：（1）阐明12种Keteleeria物种间针叶特征的种间差异及其与环境因素的协同变异关系；（2）鉴定控制关键性状的SNP位点、候选基因和多维调控网络。这些发现不仅为理解Keteleeria复杂性状的遗传调控网络和环境适应的进化机制提供了科学依据，优化了基于表型的分类系统，并为该属的资源保护策略提供了指导，同时也进一步加深了对针叶植物复杂功能性状分子调控机制的理解。
样本采集和GBS测序
在自然生境中的Keteleeria植株中，每隔50米采集一个样本，每个物种采集5个个体。从每个个体中取出15根成熟的当年生针叶，并用FAA固定液保存以进行解剖学分析。所有12种Keteleeria物种的详细采样位置见表S1。
使用改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法从针叶中提取DNA（Tel-zur等，1999），每个样本使用2克材料
针叶形态和解剖特征的比较分析
Keteleeria物种的针叶解剖结构从外到内包括以下层次：角质层、表皮、栅栏组织和中央柱。树脂管分布在叶片两侧的背表皮附近，中央柱被一系列珠状脉鞘细胞包围（图1）。在12个物种中，K. xerophila的正面和背面表皮表面都有气孔，而其他所有物种则没有气孔
针叶形态和解剖特征之间的协同关系
本研究通过比较分析12种Keteleeria物种的形态和解剖特征，研究了针叶特征的种间差异。结果显示，在测量的17个特征中，有15个特征存在显著的种间差异（p < 0.05），除了树脂管数量（始终为2条）和表皮厚度，这与裸子植物中已知的显著种间变异模式一致
结论
本研究通过全面的形态学、解剖学分析和生态适应性研究以及GWAS，系统地阐明了12种Keteleeria物种针叶特征的变异模式和遗传基础。结果显示，在测量的17个特征中，有15个特征存在显著的种间差异（p < 0.01），树脂管数量（始终为2条）和表皮厚度除外。针叶特征表现出明显的共变模式，例如针叶长度与...
作者贡献
袁彦超：撰写原始草稿、数据可视化、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。王俊辉：监督、概念构建。张培：实验设计。郭玉峰、王志勇：数据管理。刘世荣：监督、概念构建。贾子瑞：资金筹集、撰写-审稿与编辑、数据分析、概念构建。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（32271694）的财政支持。
数据可用性
本研究的支持数据已公开共享。本文报告的序列的NCBI登录号在“Accession numbers”部分给出。所有其他研究数据包含在文章和支持信息中。
CRediT作者贡献声明
袁彦超：撰写原始草稿、数据可视化、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。王俊辉：监督、概念构建。张培：实验设计。郭玉峰：数据管理。王志勇：数据管理。刘世荣：监督、概念构建。贾子瑞：资金筹集、撰写-审稿与编辑、数据分析、概念构建。
