一种针对线粒体的纳米马达，配备三酶级联系统，用于协同抗肿瘤治疗

《Chemical Engineering Journal》：A mitochondria-targeting nanomotor with tri-enzyme cascades for synergistic antitumor therapy

肿瘤靶向三酶纳米马达通过ATRP聚合实现葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和过氧化氢酶共固定化，形成稳定肿瘤选择性的纳米聚集物。系统通过葡萄糖氧化生成过氧化氢，经过氧化氢酶催化产氧并产生羟基自由基，实现自维持催化循环。氧气缓解肿瘤缺氧并驱动纳米马达自主运动，增强深部肿瘤渗透和细胞摄取效率。体外及体内实验证实该体系通过饥饿疗法、化学动力学治疗和线粒体靶向氧化损伤协同作用显著抑制肿瘤生长，为智能自推进纳米治疗开辟新路径。

　　

黄立伟|魏文昭|吕玲|罗彦明|范慧慧|朱灿红|王婷婷|刘俊秋

教育部有机硅化学与材料技术重点实验室，杭州师范大学材料学院、化学与化学工程学院有机硅材料技术重点实验室，中国浙江省杭州市311121

摘要

基于酶的癌症疗法的治疗效果通常受到输送效率低、催化稳定性差以及肿瘤微环境（TME）中酶促反应自我限制的影响。为克服这些挑战，我们通过一步表面聚合方法开发了一种多功能三酶纳米马达。葡萄糖氧化酶（GOX）、辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢酶（CAT）利用原子转移自由基聚合（ATRP）与靶向线粒体的单体共固定并功能化，从而形成稳定的、选择性作用于肿瘤的纳米聚集体。该系统实现了自我维持的催化循环：GOX消耗肿瘤内的葡萄糖生成H?O?，HRP将其转化为高细胞毒性的羟基自由基（•OH），CAT再将多余的H?O?分解为氧气。这种氧气不仅缓解了缺氧状况，维持了GOX/HRP的级联反应，还通过持续释放氧气气泡推动纳米马达运动。这种自主运动显著增强了肿瘤深部渗透能力和细胞摄取效率。体外和体内研究表明，这些纳米聚集体通过结合饥饿疗法、化学动力学疗法和靶向线粒体的氧化损伤，产生了强大的协同抗肿瘤效果，显著抑制了肿瘤生长。这项工作为从静态纳米治疗向智能、自推进系统的发展开辟了新途径。

引言

癌症仍然是全球健康领域面临的最严峻挑战之一，传统的化疗和放疗方法常常受到全身毒性、药物耐药性和治疗效果有限的困扰[1]、[2]、[3]。独特的肿瘤微环境（TME）具有低氧、弱酸性、高葡萄糖浓度和过量过氧化氢（H?O?）的特点，为靶向治疗策略提供了潜在途径[4]。近年来，酶介导的疗法成为癌症治疗领域极具前景的方向。它利用特定的生化反应在局部生成细胞毒性物质，从而将非靶向效应降到最低[5]、[6]、[7]、[8]。其中，酶级联系统因其能够模拟活细胞中的复杂代谢途径而受到广泛关注，并可通过一系列协同反应放大治疗效果。

这种方法的关键组成部分是葡萄糖氧化酶（GOX），它催化肿瘤内葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢（H?O?）[9]、[10]。为了克服GOX单一疗法的局限性，引入了基于GOX的级联反应。辣根过氧化物酶（HRP）可以与GOX一起使用，利用原位生成的H?O?将其转化为高细胞毒性的羟基自由基（•OH），对脂质、蛋白质和DNA造成严重氧化损伤[11]、[12]。尽管GOX-HRP级联系统表现出增强的细胞毒性，但仍面临两个关键挑战，阻碍其临床应用：首先，由于氧气耗尽，级联反应具有自我限制性。GOX催化的反应会消耗氧气，迅速导致肿瘤微环境严重缺氧，这不仅抑制了其自身的活性，还可能促进肿瘤侵袭和转移[13]；其次，自由酶的全身给药往往导致稳定性差、清除速度快和生物分布不均，无法有效在肿瘤部位积累[14]、[15]。因此，开发一种能够稳定酶、缓解缺氧并确保靶向药物递送的递送平台至关重要[16]、[17]、[18]、[19]。最近的研究探索了多种策略来应对这些挑战。例如，李等人开发了一种模拟中性粒细胞的纳米酶，利用GOX自我供应H?O?和氯过氧化物酶（CPO）生成单线态氧（¹O?），从而通过酶级联反应实现高效的抗菌活性[20]；同样，卢等人开发了一种掺铜的多孔多巴胺纳米酶，并通过类似超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性放大线粒体氧化应激，有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD）用于癌症免疫治疗[21]；此外，林等人报道了一种基于混合膜的仿生纳米药物，通过级联反应生成近红外-II激光诱导的过氧亚硝酸盐（ONOO^?），通过增强免疫激活实现强抗肿瘤效果[22]。

尽管取得了这些进展，但上述平台都无法在温和条件下同时实现多种天然酶的共固定，并提供足够的氧气供应以克服GOX引起的缺氧。目前的酶固定策略，如金属有机框架（MOFs）[23]、[24]、[25]和共价有机框架（COFs）[26]、[27]、[28]、[29]，虽然具有较高的负载能力和结构保护性，但通常需要苛刻的合成条件，可能影响酶的活性。替代方法，如物理吸附[30]、[31]、[32]、[33]，往往导致酶泄漏，从而降低递送效率。相比之下，在温和条件下合成的聚合物提供了更合适的替代方案，具有良好的生物相容性，能够实现多种天然酶的共固定并保持其催化活性。

在这里，我们报道了一种构建多功能纳米聚集体的策略，这些纳米聚集体可作为协同抗肿瘤治疗的纳米马达。这是通过将改性的GOX、HRP和CAT与丙烯酰胺（AAM）及靶向线粒体的三苯基膦（TPP）单体通过原子转移自由基聚合（ATRP）直接共聚实现的。这种精心设计实现了两个关键功能：它形成了一层保护性的水凝胶状层，增强了酶的稳定性，并在表面功能化活性靶向配体，以促进特定肿瘤细胞的摄取。由此形成的三酶级联（GOX-HRP-CAT）系统中，GOX消耗葡萄糖生成H?O?，HRP将H?O?转化为•OH，CAT将H?O?转化为O?，从而缓解肿瘤缺氧并防止H?O?对健康组织的毒性作用。氧气还作为自主运动的驱动力。这种自主运动显著提高了治疗效果，通过改善肿瘤内渗透和细胞内化，增强了癌细胞的摄取。我们预计，这种多功能系统将通过整合饥饿疗法、氧化应激和缺氧缓解机制，展现出卓越的稳定性、靶向线粒体的能力以及强大的协同抗肿瘤活性。这项工作标志着从静态纳米治疗向智能、自推进系统的重大进步，为抗肿瘤治疗指明了新的方向。

部分片段

GCH-P的合成与表征

在本研究中，合成了一种N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的ATRP引发剂1-((2,5-二氧吡咯烷-1-氧基)-1-氧代-2,5,8,11-四氧十三烷-13-基2-溴-2-甲基丙酸酯（succinimidyl-TEG-Br），其分子结构通过¹H NMR光谱和电喷雾离子化（ESI）质谱得到确认（图S1–4）。随后将该引发剂与葡萄糖氧化酶（GOX）、辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢酶（CAT）结合，成功获得了GOX-Br、HRPBr和CATBr

结论

总结来说，我们通过ATRP策略成功开发了一种新型的多功能三酶级联纳米聚集体。该系统能够同时固定GOX、HRP和CAT以及靶向线粒体的单体，有效解决了基于酶的抗癌治疗中的关键瓶颈问题。这种一步合成策略使得三种酶在纳米尺度上紧密共存，巧妙地解决了传统方法的几个关键限制。

CRediT作者贡献声明

黄立伟：撰写 – 原始草案，数据整理。魏文昭：数据整理。吕玲：形式分析。罗彦明：可视化。范慧慧：可视化。朱灿红：数据整理。王婷婷：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。刘俊秋：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号：22201058、22161142015）的财政支持。所有动物实验均在杭州师范大学实验动物中心进行，并获得了该中心伦理委员会的批准。