《Chemical Engineering Journal》：Self-powered photosynthetic microalgae hydrogel for bioelectric–oxygen–hydrogen–ATP and vesicular Nanotherapy–synergized osteoarthritis mitigation
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本研究开发了一种近红外激活的光合微藻水凝胶，通过释放氧气、氢气和ATP，结合外泌体递送 diferuloylmethane，有效调控巨噬细胞极化，抑制成纤维细胞并促进软骨修复，在OA治疗中展现出安全性和有效性。
曾宇文|翁佩薇|卢显宗|刘佳宏|陈彦婷|吴慎翰|阮孝忠|庄安德鲁·E·Y
台北医学大学生物医学工程学院生物医学材料与组织工程研究生院，国际生物医学工程博士项目，新北市235603，台湾
摘要
骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其特征是软骨侵蚀、滑膜炎症和缺氧引起的疼痛，然而改变疾病进程的疗法仍然难以实现。在这里，我们介绍了一种光合微藻水凝胶（ALG–TYR/CHL/pEV@DIF），它结合了小球藻衍生的氧气、氢气、生物电能和ATP微生成技术，并嵌入了含有 diferuloylmethane（pEV@DIF）的光动力活性血小板外泌体，这些外泌体被包裹在藻酸盐-酪胺支架中。在近红外（NIR）光照射下，这种活性结构能够同时增强O?/H?/ATP的释放和生物电信号传导，将促炎性的CD86+ M1巨噬细胞重新编程为修复性的CD206+ M2表型，选择性减少成纤维细胞的存活同时保持软骨细胞的活力，并在压缩作用下增强水凝胶的机械性能。在大鼠骨关节炎模型中，该水凝胶使关节温度恢复正常，在T2加权MRI图像中显示出接近健康的软骨水合状态，并提高了步态频率，反映了显著的疼痛缓解效果。组织学和免疫荧光分析进一步显示胶原蛋白II的表达上调，TNF-α和HIF-1α的表达受到抑制，且没有出现脱靶毒性。尽管这些方法超出了本研究的范围，但放射学和行为数据集可能为未来的定量图像和运动分析提供有用的基础。
引言
骨关节炎（OA）是一种慢性进行性炎症性关节疾病，其特征是关节软骨退化、滑膜炎症和软骨下骨重塑[1]，[2]。病理过程涉及软骨细胞凋亡以及细胞外基质（ECM）合成与降解之间的失衡[3]，[4]，[5]，导致关节疼痛、僵硬和活动能力下降[6]，[7]，[8]。OA的一个标志性特征是滑膜炎，表现为滑膜增生、纤维化和免疫细胞浸润[9]，[10]。这种炎症反馈循环加剧了软骨破坏并加速了OA的进展，因此需要针对关节微环境中的炎症驱动的缺氧和氧化应激进行治疗。
传统的药物干预措施——如非甾体抗炎药、糖皮质激素和蛋白质类疗法——主要缓解症状，但无法阻止疾病进展。长期使用这些药物常常会引起不良反应，包括胃肠道损伤和骨髓抑制。手术方法如滑膜切除术可以暂时缓解症状，但受到创伤、术后粘连和复发等因素的限制[11]。因此，迫切需要安全有效的OA疗法，既能调节炎症又能促进软骨再生。
巨噬细胞在OA的发病机制中起着核心作用[12]，[13]，[14]。在关节炎滑膜中，巨噬细胞被招募并主要向促炎性M1表型极化，释放细胞因子如白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α，从而加剧关节炎症和软骨破坏[15]。这些细胞因子还激活了类似成纤维细胞的滑膜细胞（FLS），进一步促进细胞因子释放和血管生成。这一级联反应增加了关节内的氧气需求，导致局部缺氧和缺氧诱导因子（HIF）-1α的上调，进一步强化了M1巨噬细胞的极化[16]。因此，巨噬细胞是重新编程炎症微环境和阻止OA进展的理想靶点。
发炎的滑膜组织还表现出血管通透性增强，形成高达700纳米的内皮间隙，使得纳米颗粒（NP）通过“ELVIS”效应（通过渗漏的血管外渗并随后被炎症细胞捕获）积累[17]，[18]。利用这一机制，纳米载体已被探索用于针对OA的治疗，能够将药物、核酸和酶直接递送到活化的巨噬细胞[19]，[20]，[21]，[22]，[23]。然而，大多数纳米平台依赖于氧依赖性的光动力疗法（PDT）或单一药物，这两种方法都受到炎症微环境中缺氧的限制。
PDT是一种非侵入性的光触发治疗，通过氧气生成活性氧（ROS）来诱导过度增殖细胞的凋亡[24]，[25]，[26]，[27]，[28]，[29]。有趣的是，关节炎滑膜微环境与实体肿瘤具有许多共同特征——高代谢、血管生成和缺氧——这使得PDT成为关节炎治疗的可行策略[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]，[36]。然而，传统PDT的效果受到氧气供应不足的阻碍，因为炎症和光照都会消耗氧气，从而加剧局部缺氧。这种限制也导致HIF-1α的过度表达，进一步强化了M1巨噬细胞的极化，导致疾病复发。因此，逆转缺氧和重新编程巨噬细胞表型对于提高PDT的效果和实现持久的OA缓解至关重要。为了克服这些挑战，已经设计了能够生成氧气的纳米平台来减轻缺氧并促进M2巨噬细胞的极化[37]，[38]，[39]。然而，一个能够持续供应氧气、支持生物电和氧化还原调节并同时实现光动力激活的理想系统仍然难以实现。
小球藻（CHL）是一种绿色微藻，可作为自给自足的光合微反应器，为开发微藻系统提供了天然基础。在光照下，CHL不仅生成氧气，还生成氢气和生物电信号[40]，[41]，这些都有助于抗炎和促进M2表型的效果[42]，[43]。基于这一概念，我们设计了一种响应巨噬细胞的、光合的外泌体纳米平台，其中血小板外泌体包裹的diferuloylmethane（pEV@DIF）与CHL结合在藻酸盐-酪胺（ALG–TYR）水凝胶中（图1）。在这种混合结构中，DIF既具有抗氧化作用，又可作为近红外（NIR）光敏剂，实现深层组织的激活和实时成像。
在关节内注射并接受NIR照射后，ALG–TYR/CHL/pEV@DIF水凝胶协调了一系列能量转换和治疗过程。光合的小球藻补充氧气以增强光动力疗法（PDT）的效果并缓解缺氧，而DIF则增强ROS的生成以实现局部光毒性，pEVs向巨噬细胞传递抗炎和再生信号。同时，CHL衍生的H?和生物电信号促进巨噬细胞从促炎性M1表型向修复性M2表型的极化，从而支持组织修复和代谢稳态。
除了生成O?和H?外，小球藻的光合装置还充当细胞内的ATP生成器[44]，将光能转化为生化能量，为代谢压力下的组织恢复提供动力。在660纳米光照下，这种光诱导的光磷酸化补充了细胞内的ATP储备，恢复了缺氧或炎症微环境中的生物能量平衡。最近关于基于微藻系统的研究表明，光合作用驱动的ATP生成可以减轻氧化损伤、抑制炎症级联反应，并加速缺血条件下的组织再生[45]。受这些发现的启发，我们的设计结合了小球藻介导的ATP生成和水凝胶基质中的治疗气体生成，提供了一个自给自足的生物能量驱动机制，补充了囊泡纳米疗法和光动力调节。这种自驱动的多模式生物混合平台结合了光触发的O?/H?/ATP生成、生物电调节和外泌体信号传导，以重新编程炎症微环境并实现持久的骨关节炎缓解。
材料
DIF、ALG、TYR和脂多糖（LPS）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。所有化学品均为分析级，未经进一步纯化即使用。胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和抗生素来自Gibco BRL（美国纽约州格兰德岛）。Wistar大鼠由Biolasco（台湾台北）提供，RAW 264.7和L929细胞系来自ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。人类血小板来自
pEV@DIF配方的优化
通过NTA（动态光散射分析）首次研究了超声波处理和过滤后的pEV纳米载体的物理化学特性。NTA显示其分布范围狭窄，单峰分布，中心波长为162.5±2.8纳米，粒径密度为2.12×10^8粒子/毫升（图1A）[52]。为了明确药物加载对胶体行为的影响，我们改变了pEV与DIF的重量比，从1:0变化到1:0.8，并绘制了流体动力学尺寸和ζ电位（图1B）。未加载的pEVs（1:0）的平均直径为
讨论
最近的研究越来越多地表明，有效的OA干预不仅需要保护软骨，还需要更广泛地调节关节微环境并支持再生修复[58]，[59]，[60]。我们的发现将660纳米激活的ALG-TYR/CHL/pEV@DIF结构置于几个快速发展的治疗概念的交汇点。在先前的研究中，透射电子显微镜（TEM）显示pEVs具有囊泡形态。尺寸分布
结论
本研究提出了一种活性的、光控水凝胶，它结合了藻酸盐-酪胺化学、血小板衍生的外泌体、小球藻CHL和660纳米激活的diferuloylmethane，形成了一个简单、微创的OA植入物。体外实验中，该复合材料按需生成氧气和氢气，并产生光电流，在660纳米照射下变硬，同时保护软骨细胞并减少成纤维细胞，将巨噬细胞重新编程为M2表型。体内实验中，一次关节内注射后
CRediT作者贡献声明
曾宇文：研究。翁佩薇：研究。卢显宗：研究。刘佳宏：研究。陈彦婷：研究。吴慎翰：研究。阮孝忠：研究。庄安德鲁·E·Y：研究。
伦理批准和参与同意
本研究得到了台北医学大学动物伦理和使用委员会的批准。
致谢
本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC）（R.O·C）通过拨款114-2124-M-038-003、114-2628-E-038-001-MY3和112-2221-E-038-002-MY3的支持，以及台北医学大学–双和医院（114TMU-SHH-30）和台湾国家卫生研究院（NHRI）（R.O·C）通过NHRI-EX113-11323EI的支持。
