轮枝镰刀菌侵染下玉米叶生长的lncRNA介导ceRNA调控网络：聚焦miR396与miR319的作用

《Annals of Applied Biology》：Evaluating putative lncRNA-mediated ceRNA regulatory network involving miR396 and miR319 in maize leaf growth under Fusarium verticillioides infection

为解析轮枝镰刀菌侵染下玉米叶生长受阻的分子机制，研究者围绕miR396-GRF15-lnc396与miR319-TCP-lnc319两条ceRNA通路开展多组学验证，明确了耐受与感病自交系在细胞增殖、扩张及ROS稳态上的差异调控模式，为玉米抗病育种提供了新靶点。

　　

玉米是全球第三大消费作物，广泛用于口粮、饲料与生物燃料，同时也是研究植物器官生长调控的经典模式。然而，由拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）引起的苗枯、穗腐和茎腐等病害，可导致玉米减产30%–50%，其产生的伏马菌素还对人与动物健康构成威胁。气候变化带来的环境波动还可能削弱植物防御、加剧病原菌危害，因而解析玉米与F. verticillioides互作的分子机制，对培育稳定、抗病品种具有重要意义。

植物器官生长依赖细胞数目增加（细胞分裂）与细胞体积增大（细胞扩张）的协同。玉米叶片生长呈明显的线性分区特征：从叶基部向叶尖依次为分生区（meristem, Me）、伸长区（elongation zone, El）和分化区（differentiation zone, Dz）；细胞分裂主要在分生区进行，进入伸长区后分裂停止并开始扩张，至分化区达到终末细胞大小。此前研究已表明，microRNA（miRNA）如miR396、miR319可通过靶向生长调控因子（GRF）和TCP转录因子，影响细胞增殖与器官发育；长链非编码RNA（lncRNA）则可作为竞争性内源RNA（ceRNA），通过共享miRNA响应元件（MRE）“吸附”miRNA，间接保护靶mRNA不被沉默。但在F. verticillioides侵染背景下，lncRNA是否参与玉米叶生长区的ceRNA网络、以及不同抗性基因型如何差异化调控这些通路，仍不清楚。为此，相关研究团队以耐受（R：ADK310）与感病（S：ADK1188）玉米自交系为材料，进行土壤接种侵染，整合表型与细胞运动学分析、抗氧化酶检测、生物信息学预测与生长区空间分辨的转录定量，系统评估了miR396–GRF15–lnc396与miR319–TCP–lnc319等ceRNA网络在叶生长响应中的作用，论文发表于《Annals of Applied Biology》。

主要关键技术方法：选用耐受（ADK310）与感病（ADK1188）玉米自交系（种子来自土耳其Sakarya玉米研究所），设置对照（C）与F. verticillioides接种（I）处理，采用完全随机设计；通过土壤接种法建立侵染，每日监测表型并观察叶表面真菌结构（DIC显微镜）；以第6叶（L6）为对象，连续测量叶长并计算叶伸长率（LER），在稳态生长期采集叶基部12 cm并分段，借助DAPI染色确定分生区长度，利用ImageJ测量表皮细胞长度（CL）并推导细胞生产（P）、细胞分裂速率（D）、细胞周期时间（T_c）、细胞扩张时间（T_d）等变量；按Me（0–1.5 cm）、El（4–6 cm）、Dz（10–12 cm）取样进行总蛋白提取与抗氧化酶（CAT、POX、APX、GR、SOD）活性测定；基于miRBase与MaizeGDB获取miR396/miR319及GRF/TCP序列，结合实验室未发表转录组数据得到lnc396（TCONS_00089187）与lnc319（TCONS_00028828），用psRNATarget与RNAhybrid预测miRNA–mRNA/lncRNA互作并构建ceRNA网络；通过TRIzol提取RNA，分别用常规与stem-loop RT合成mRNA/lncRNA与miRNA的cDNA，以β-tubulin为内参，开展qRT-PCR定量，数据经log2转换后以三因素ANOVA与LSD进行统计比较。

3 结果

3.1 表型与细胞水平评估玉米自交系对F. verticillioides的响应

第6叶完成生长的时间，对照（C）株系为23天，接种（I）株系缩短至18天。最终叶长（FLL）在RI（R接种）较RC（R对照）下降16%，在SI（S接种）较SC（S对照）下降26%。对数生长期的叶伸长率（LER）在RI较RC上升8%，而在SI较SC下降19%。细胞长度（CL）剖面显示，分生区细胞长度在RI较RC降低12%（不显著），在SI较SC降低19%（不显著）；分化区细胞长度在RI较RC降低5%（显著），SI较SC降低6%（不显著）。结果表明F. verticillioides抑制玉米第6叶生长，且感病自交系的生长受限更明显。

3.2 第6叶运动学分析

侵染显著影响分生区长度（L_me）、伸长区长度（L_el）、生长区总长（L_gz）与细胞生产（P），但生长区内细胞总数（N_ma）无显著处理或品系差异。分生区细胞数（N_me）与伸长区细胞数（N_el）在接种与对照间差异显著；N_el、细胞分裂速率（D）与细胞周期时间（T_c）存在品系×区互作，细胞扩张时间（T_d）则受品系、处理与区的影响。具体来看：D在RI较RC升高7%（不显著），而在SI较SC显著降低31%；T_c在RI较RC降低8%（不显著），在SI较SC显著延长42%；T_d在RI较RC显著缩短13%。综上，感病自交系的生长抑制与细胞分裂受限、细胞周期延长关系密切；耐受自交系的生长下降则更多伴随细胞扩张进程提前终止。

3.3 显微镜下观察F. verticillioides在玉米叶面的结构

接种苗的第1、2叶可见气生菌丝与孢子附着，孢子可在气孔开口周围聚集；对照叶未见此类结构。本研究显微流程主要检测叶面相关结构，未直接展示侵入或内部感染性菌丝。

3.4 玉米生长区抗氧化酶活性对F. verticillioides侵染的响应

CAT活性在Me、El、Dz间差异显著，整体呈Me高、向后下降的趋势，品系间差异不大。POX活性受品系、处理与区影响，RI的Me与El高于Dz，SI的El较SC的El降低。APX活性在区、处理及多类交互作用中差异显著，各株系均为Me最高；RI的Me较RC的Me升高约4.5倍，SI的Me较SC的Me升高约2倍。GR活性无显著区/处理/品系差异。SOD活性受处理与区影响，且区效应随处理变化：RI的El较RC的El升高，Me与Dz较对应对照降低；SI的Me较SC的Me降低，Dz较SC的Dz降低。结果表明氧化还原相关酶在生长区呈现高度空间特异性，耐受与感病自交系在Me区的CAT、APX上调模式值得关注。

3.5 ceRNA互作网络的生物信息学预测

从MaizeGDB获取Zm-B73-Reference-NAM-5.0下的GRF（16个）与TCP（37个）转录本，从miRBase获取miR319（4个）与miR396（8个）前体序列，lncRNA序列来自实验室F. verticillioides侵染玉米转录组数据。通过MEGA 11构建邻接树并进行支持率评估；利用psRNATarget与RNAhybrid预测靶向关系，聚焦同时具可靠MRE、在叶生长区有表达且呈感染相关变化的分子。预测显示miR319可靶向5个TCP与6个lncRNA，miR396可靶向12个GRF与7个lncRNA；其中miR396–GRF15–lnc396（ceR396）与miR319–TCP38/TCP5–lnc319（ceR319）被选作重点网络，并在Cytoscape中可视化。

3.6 玉米第6叶生长区候选ceRNA网络的转录验证

在ceR319中，miR319表达在品系、区及交互作用中差异显著：SI的Me较SC的Me下调至约0.125倍，El上调约6倍，Dz上调约1.5倍；RI的Me较RC的Me下调至约0.33倍。lnc319在SI的El较SC的El上调约3倍、Dz下调至约0.33倍；RI的El较RC的El上调约3倍、Dz上调约4倍。TCP38在RI的Me较RC的Me上调约2倍、Dz上调约4倍；TCP5在RI的Dz较RC的Dz上调约5倍；SI中TCP38与TCP5未见显著变化。

在ceR396中，miR396表达在品系、区及交互作用中差异显著：SI的El较SC的El下调至约0.5倍；RI的Me较RC的Me上调约1.5倍、Dz下调至约0.56倍。lnc396在SI的Me较SC的Me下调至约0.5倍；RI的Me较RC的Me下调至约0.42倍、Dz上调约2倍。GRF15在RI较对应对照在Me、El、Dz分别上调约2、3、2倍；SI的Dz较SC的Dz下调至约0.5倍。

结论与讨论：本研究在F. verticillioides侵染下，将玉米第6叶生长受限解析到细胞运动学变量，并把氧化还原酶空间分布与生长区分区联系起来，同时提出了lncRNA可能通过ceRNA机制参与叶生长调控的证据链。感病自交系SI的生长下降主要关联细胞分裂速率下降与细胞周期时间延长，而分生区GRF15转录水平变化不明显，提示除GRF15外还可能涉及其他GRF或上游因素；Me区lnc396下调则暗示其可能作为miR396“海绵”参与分生区分裂相关调控。耐受自交系RI的生长下降更多与细胞扩张时间缩短相关，RI中miR319在Me下调、lnc319在远端区上调，同时TCP38/TCP5在对应区上调，符合“更早分化/更快发育进程”的解释框架，并可能与生长—防御权衡及防御相关激素通路交互有关。需要注意的是，所述ceRNA网络目前基于生物信息学预测与相关表达模式，尚待通过miRNA功能扰动（过表达/靶 mimicry）、降解组或5′ RLM-RACE等进一步验证；此外，F. verticillioides侵染可引发生长素、茉莉酸、水杨酸、脱落酸、赤霉素等激素重编程，并可能通过系统性 redox/激素信号影响第6叶不同区，因此观察到的表达变化也可能反映更广泛的生长—防御协同重塑。总体而言，该研究首次在生物胁迫下把lncRNA引入玉米叶生长区的ceRNA分析框架，为理解基因型依赖的叶生长响应及挖掘分子育种靶点提供了重要线索。