利用近红外荧光探针对超氧阴离子进行靶向成像，以实现肿瘤的精准诊断

《Dyes and Pigments》：Targeted Imaging of Superoxide Anion with a Near-Infrared Fluorescent Probe for Tumor Precise Diagnosis

超氧阴离子特异性近红外荧光探针Cy-O???的设计及其在肿瘤成像中的应用。该探针通过三氟甲磺酸基团与O???的特异性反应释放荧光素，实现742 nm处荧光增强，具有高灵敏度、选择性及生物相容性，成功用于细胞内和活体肿瘤模型中O???动态监测及肿瘤精准成像。

　　

张军|李丹|马晓亮|魏金鑫|王慧敏|陈旺生|余法彪|王瑞

中国海南省医学大学生命科学与医学技术学院，海南省生物智能材料与生物医学设备工程研究中心，海南省热带疾病控制重点实验室，功能性材料与分子成像重点实验室，海口市，571199

摘要

超氧阴离子（O₂^•?）是一种关键的活性氧物种，与氧化应激相关疾病有关，在肿瘤细胞中通常过量产生，因此是癌症诊断的重要生物标志物。本文报道了一种近红外（NIR）荧光探针Cy-O₂^•?，可用于选择性成像O₂^•?并精确识别肿瘤。Cy-O₂^•?基于半花青素荧光团合理设计，其中三氟甲磺酸基团作为特异性O₂^•?识别单元。在未反应状态下，由于分子内电荷转移（ICT）过程被阻断，荧光被有效抑制。当与O₂^•?反应时，亲核攻击导致O–S键断裂，释放出自由的半花青素荧光团，从而恢复近红外荧光信号（约742 nm）。Cy-O₂^•?具有高灵敏度、对O₂^•?的优异选择性以及对生物体的良好相容性。细胞实验表明其能够监测内源性和外源性O₂^•?的变化。更重要的是，在携带肿瘤的小鼠模型中进行体内成像可精确显示肿瘤，显示出其在早期肿瘤诊断中的潜力。

引言

活性氧（ROS）在多种生理和病理过程中起着关键作用[1]，[2]。其中，超氧阴离子（O₂^•?）是细胞呼吸过程中产生的主要ROS，并作为许多其他ROS的前体[3]。值得注意的是，癌细胞中的代谢重编程和线粒体功能障碍会导致持续的氧化应激，表现为ROS的异常过量产生，这可能促进肿瘤的发生、进展和氧化还原驱动的代谢重塑[4]，[6]，使其成为多种恶性肿瘤的有希望的诊断生物标志物[7]，[8]。因此，在活体系统中选择性检测和可视化O₂^•?对于理解肿瘤的氧化还原生物学和开发诊断策略具有重要意义。虽然传统的成像方法如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）可以提供重要的解剖信息，但它们往往缺乏检测早期肿瘤相关的代谢改变和分子特征的灵敏度[9]，[10]。

荧光成像作为一种强大的工具，由于其高灵敏度、无创性和出色的时空分辨率[11]，[12]，[13]，[13]，已成为监测生物系统中活性氧的理想方法[14]，[15]，[16]。特别是近红外（NIR，700–900 nm）区域的荧光具有更好的组织穿透深度和最小的自荧光干扰，使其非常适合体内应用[14]，[15]，[16]。最近，已经报道了几种用于ROS的荧光探针。设计出对O₂^•?具有高选择性和灵敏度的可激活NIR探针，用于体内肿瘤成像仍然是一个重要挑战[17]，[18]。大多数现有探针存在局限性，如对其他ROS的选择性不足、发射波长较短，或在复杂生物环境中的信噪比较低，以及适用范围有限[19]，[20]，[21]。特别是NIR荧光探针因其更深的组织穿透力、较低的光损伤和较低的自荧光而备受青睐，这对于体内肿瘤成像至关重要[22]，[23]。

基于反应的“开启”荧光探针通过将特定化学反应转化为荧光信号，从而提高了检测准确性和信噪比[24]。半花青素染料因其大的摩尔消光系数、可调的光学性质和良好的生物相容性而受到广泛关注，作为NIR荧光团[25]，[26]。同时，选择合适的响应识别单元对于实现对O₂^•?的高特异性至关重要。三氟甲磺酸基团极易受到超氧阴离子的亲核攻击，随后释放出具有高荧光信号的荧光团，使其成为设计超氧响应探针的有希望的触发剂[27]，[28]。例如，基于半花青素的探针LW-OTf被报道为一种双响应平台，对O₂^•?产生NIR荧光，对ONOO^?产生双光子荧光，并成功应用于药物诱导的肝损伤成像[29]。此外，其他报道的O₂^•?探针主要在癫痫、肝损伤、细菌应激或炎症疾病相关模型中得到验证。然而，如表1所示，许多这些探针仍存在局限性，如发射波长较短、应用场景有限或不适合体内肿瘤成像[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]，[36]。

本文报道了一种NIR荧光探针Cy-O₂^•?，用于选择性成像O₂^•?并精确识别肿瘤。Cy-O₂^•?通过用三氟甲磺酸基团修饰半花青素荧光团构建，有效抑制了分子内电荷转移（ICT）和荧光发射。与O₂^•?反应时，亲核攻击导致O–S键断裂，释放出自由的半花青素荧光团，从而在742 nm处产生明显的近红外荧光信号（图1）。该探针具有高灵敏度、优异的选择性和良好的生物相容性，能够动态监测活细胞中的O₂^•?变化。重要的是，Cy-O₂^•?能够在携带肿瘤的小鼠模型中清晰区分肿瘤组织和正常组织，显示出其作为早期肿瘤诊断的强大化学工具的潜力。

合成方法

在氩气保护下，将50 mg的Cy-OH溶解在1 mL无水二氯甲烷中，然后在0 °C下逐滴加入15 μL的三氟甲磺酸酐到反应溶液中。搅拌5分钟后，用冰水淬灭反应。有机相被提取、浓缩，并直接通过柱层析法（使用二氯甲烷/甲醇（DCM:MeOH = 100:3）作为洗脱剂进行纯化，得到紫色固体化合物，产率为45%。¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）δ 8.70 (d, J

Cy-O₂^•?的设计、合成和传感反应

Cy-O₂^•?的合成路线如图S1所示。简而言之，在惰性气氛下，Cy-OH与无水二氯甲烷中的三氟甲磺酸酐反应生成Cy-O₂^•?。Cy-O₂^•?的化学结构通过NMR和高分辨率质谱得到了充分表征（图S2）。

Cy-O₂^•?中的三氟甲磺酸基团既起到荧光淬灭作用，又作为O₂^•?的特异性识别位点。当暴露于O₂^•?时，

结论

总结来说，我们成功开发了一种新型NIR荧光开启探针Cy-O₂^•?，用于特异性检测O₂^•?和肿瘤成像。Cy-O₂^•?通过O₂^•?触发的断裂反应起作用，释放出半花青素荧光团并恢复分子内电荷转移，从而在742 nm处产生明显的近红外荧光增强。Cy-O₂^•?能够在活细胞中可靠地监测外源性和内源性O₂^•?的变化。

CRediT作者贡献声明

余法彪：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。张军：撰写 – 原始草稿，可视化，数据管理，概念构思。李丹：撰写 – 原始草稿，实验研究，形式分析。陈旺生：撰写 – 审稿与编辑，监督，实验研究。王瑞：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。马晓亮：撰写 – 审稿与编辑，可视化。魏金鑫：可视化，验证。王慧敏：

未引用的参考文献

[5]。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（批准号：22507034）、海南省教育厅（项目编号：Hnky2023ZD-11）、海南省研究生创新研究项目（Qhyb2023-185）、海南医学院的学术提升支持计划（XSTS2025120、XSTS2025181）、海南省临床医疗中心（2021年）、海南医学院的本科生研究与创新培训计划（2025年）以及科学的支持。