通过壳聚糖-焦磷酸钙杂化纳米花增强双酶系统的酸性催化性能，以实现手性醇的高效合成

《Enzyme and Microbial Technology》：Enhancing acidic catalytic performance of dual-enzyme system through chitosan-calcium pyrophosphate hybrid nanoflowers for efficient synthesis of chiral alcohols

该研究采用离子凝胶化和生物模拟矿化法共固定化葡萄糖脱氢酶（GDH）和羰基还原酶（CR），构建壳聚糖-磷酸钙复合纳米花载体（CR/GDH-@Ca?P?O?）。通过优化金属离子类型与浓度、三聚磷酸盐与壳聚糖比例、酶负载量等条件，纳米花结构获得SEM、FTIR、XRD及XPS证实，其高比表面积显著降低传质阻力。酸性条件下，固定化酶系统催化效率提升3.25倍，pH稳定性增强，经6次循环后仍保留60%活性。结果表明，该载体可有效提升双酶协同催化效能，为手性醇类不对称合成提供高效生物催化剂。

　　

王亚东|范书宇|杨新鹏|陈鹏|王凤环

教育部老年营养与健康重点实验室，北京工商大学（BTBU），北京100048，中国

摘要

手性醇的合成在制药应用中至关重要。本研究采用离子凝胶化和仿生矿化技术共固定葡萄糖脱氢酶（GDH）和羰基还原酶（CR），制备了一种壳聚糖-焦磷酸钙杂化纳米花酶（CR/GDH-@Ca?P?O?），用于合成手性醇化合物乙基(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯。研究了纳米花酶的合成条件，包括金属离子类型和浓度、TPP和壳聚糖浓度以及酶浓度。通过扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）对CR/GDH-@Ca?P?O?进行了表征，证实了两种酶的成功固定以及形成了高表面积的类似花的纳米结构。与游离酶相比，CR/GDH-@Ca?P?O?在pH和温度稳定性方面有所提高。特别是在酸性条件下，其催化性能显著增强，表明壳聚糖载体增强了酶在酸性环境中的耐受性。同时，CR/GDH-@Ca?P?O?表现出更强的底物亲和力和更高的V_max值，其催化效率（K_cat/K_m）达到游离酶的3.25倍。经过六次循环使用后，CR/GDH-@Ca?P?O?的催化活性仍保持60%。这些结果表明，壳聚糖整合的纳米花酶可作为高效的多功能催化剂，特别适用于酸性生物催化反应。

引言

对映体纯中间体在制药领域起着关键作用。这是因为超过五分之三的小分子治疗药物基于手性化合物。其中，手性醇作为生物活性分子的构建块，具有特别高的合成价值[1]、[2]、[3]。具体来说，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）的关键前体，这类药物被广泛用于降低胆固醇[4]、[5]。(S)-CHBE可以通过外消旋拆分或其他不对称催化方法制备。其中，使用氧化还原酶耦合的短链脱氢酶对前手性底物4-氯乙酰乙酸酯（COBE）进行不对称还原是一种高效的合成策略。这种方法具有高效率、操作简便和成本效益，使其成为生产(S)-CHBE的经济可行方法[6]。

游离酶容易受到实际应用中环境因素的影响，导致催化活性下降，并且难以回收。酶的固定提供了一种在恶劣环境条件下维持酶活性的有效策略，包括暴露于有机溶剂、极端pH值和高温[7]。虽然传统的固定技术可以提高酶的稳定性和重复使用性，但它们通常会导致酶结构发生构象变化，并引入传质限制，从而显著降低催化活性[8]、[9]。2012年，Ge等人报道了一种利用酶-金属离子配位相互作用的新酶固定方法，使用铜离子作为无机组分，酶作为有机组分来合成有机-无机杂化纳米花，有效解决了现有技术难题[10]。这些纳米花通过成核、配位、共沉淀、自组装和异质外延生长形成，具有独特的花状结构[11]。这种结构提供了更大的比表面积，从而减少了传质阻力并提高了催化效率。因此，这种方法已成为一种相对通用的固定方法，并在酶固定中显示出巨大潜力，已应用于单一酶和多酶系统的固定[12]、[13]。Patel等人证明，固定在杂化纳米花中的漆酶活性比游离酶高2.2倍，同时具有更好的储存稳定性和耐受性[14]。类似地，Sun等人实现了葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）的共固定，通过级联反应显著提高了葡萄糖检测的灵敏度[15]。然而，尽管有报道使用壳聚糖-CaP杂化纳米花进行单一酶的固定[16]、[17]，但在这种载体中实现双酶系统的共固定，尤其是在不对称合成中涉及辅因子再生的情况下，尚未进行探索。多酶共固定面临优化酶的化学计量比、空间排列和协同活性的独特挑战，这正是我们本研究旨在解决的问题。

在之前的研究中，我们开发了一种通过共固定Bacillus subtilis 168中的GDH和CR来生产(S)-CHBE的杂化纳米花系统[18]。我们发现，这种固定的双酶系统在催化活性、操作稳定性和对COBE的底物接受性方面有显著提高。然而，该系统在酸性pH条件下始终表现出较低的催化效率[18]。我们研究了在基于壳聚糖的杂化纳米花中共固定这两种酶的方法，以克服这一限制，并在酸性条件下最大化它们的催化活性。

壳聚糖（CS）是一种天然阳离子多糖，以其无毒、生物相容性和抗菌性能而闻名。壳聚糖和磷酸钙（CaP）的组合已被广泛用于硬组织工程复合支架的开发[19]、[20]。壳聚糖可以通过离子聚合作用与三聚磷酸盐快速交联，形成稳定的生物相容性纳米复合材料[21]。磷酸钙是骨骼的主要无机成分，赋予骨骼强度和刚性。这些材料具有优异的生物相容性和对生物物质（如胶原蛋白、蛋白质、酶、细胞和病毒）的强亲和力[22]、[23]。研究人员已成功利用这些性质进行酶的固定。例如，Wang等人利用壳聚糖和CaP之间的矿化反应将过氧化氢酶固定在纳米花中。固定的过氧化氢酶在50°C下表现出优异的热稳定性和操作稳定性，长时间内保持其催化活性，并在10次循环后仍保留约60%的活性[16]。这种材料不仅具有更好的稳定性 and 生物相容性，还保持了有机-无机杂化纳米花的大接触面积和高效的物质传输能力。同样，Xu等人开发了基于壳聚糖的杂化纳米花来固定蔗糖磷酸化酶。所得的蔗糖磷酸化酶在酸性条件下的活性比游离酶高2.42倍。此外，它对副产物和有机溶剂的耐受性得到改善，储存稳定性提高，在10次循环后仍保留约80%的相对活性，在15天后仍保留约75%的活性[24]。

本研究旨在利用壳聚糖杂化纳米花的结构优势，高效合成(S)-CHBE，从而在酸性反应条件下提高双酶系统的性能。为此，我们将GDH和CR共固定在壳聚糖-焦磷酸钙基质中，形成新型杂化纳米花（CR/GDH-@Ca?P?O?）。通过评估金属离子参数、酶装载量、孵育时间和培养温度等参数，系统优化了固定工艺，以提高纳米花的催化效果。我们使用SEM、FTIR、X射线和TGA对CR/GDH-@Ca?P?O?的结构特征进行了表征。我们评估了CR/GDH-@Ca?P?O?的催化性能和特性，包括：最佳pH值、最佳温度、pH稳定性、热稳定性和重复使用性。结果表明，CR/GDH-@Ca?P?O?在酸性条件下表现出优异的酶活性，显著拓宽了(S)-CHBE的制备途径。

材料

本实验中用于制备LB培养基的蛋白胨（1%）和酵母提取物粉末（0.5%）购自OXOID。琼脂粉（1.5%）和氯化钠（1%）购自Biotopped Life Science Co., Ltd。无水硫酸铜、硫酸锌、无水氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、葡萄糖和氢氧化钠购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd。COBE、(S)-CHBE、硫酸卡那霉素和氯霉素也来自该公司

蛋白质表达和纯化

携带pET-28a-GDH的E. coli在诱导后表达GDH，而携带pET-28a-CR的E. coli在诱导后表达CR。培养结束时离心发酵液，收集细菌沉淀物并洗涤。然后使用高压细胞破碎仪处理沉淀物并再次离心。上清液通过Ni柱进行蛋白质纯化，随后脱盐。所得样品加载到SDS-PAGE上分析纯度

结论

本研究采用离子凝胶化和仿生矿化技术，通过静电驱动的共固定过程将GDH和CR高效封装在CR/GDH-@Ca?P?O?纳米花中。这种固定方法不仅保留了杂化纳米花优异的传质性能，从而提高了催化效率，还结合了壳聚糖和CaP，改善了固定酶的生物相容性和稳定性。

CRediT作者贡献声明

王亚东：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据分析、概念化。王凤环：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资源获取、资金申请。陈鹏：数据分析。杨新鹏：验证。范书宇：撰写 – 初稿撰写、验证、软件使用、实验设计、数据分析、数据管理。

资金来源

北京工商大学青年学者研究基金会

（RFYS2025）。国家重点研发计划（项目编号2021YFC2102800）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者衷心感谢北京工商大学青年学者研究基金会（RFYS2025）和国家重点研发计划（项目编号2021YFC2102800）提供的支持和研究经费。