《Enzyme and Microbial Technology》：Functional expression of broccoli myrosinase in Bacillus subtilis: a GRAS microbial platform for enzyme production
编辑推荐：
利用pTTB2系统在GRAS微生物枯草芽孢杆菌中成功实现西兰花硫苷酶的异源表达，并通过对比两种转化方法（HS/LS与SM1/SM2）证明后者显著提升转化效率，获得具有催化活性的重组菌株。酶活性检测与SDS-PAGE分析证实目标蛋白表达稳定且分子量正确，为食品级生物制造平台开发奠定基础。
作者：Yarni Pozo、Andrea Mahn、Antonio Castillo
智利圣地亚哥大学（USACH）工程学院化学与生物工艺工程系，地址：Av. Libertador Bernardo O’Higgins 3363, Estación Central, Santiago, 9170022, 智利
摘要
芥子酶（β-硫葡萄糖苷葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.147）可催化葡萄糖苷类物质转化为具有生物活性的异硫氰酸酯，如莱菔硫烷，这种化合物在食品和营养保健品领域具有广泛应用前景。然而，植物来源的芥子酶供应有限且稳定性不稳定，这限制了其工业应用。本文报道了在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中异源表达西兰花芥子酶的研究结果。枯草芽孢杆菌是一种被广泛认为安全的（GRAS）微生物，常用于工业酶的生产。通过优化密码子的方法，我们将芥子酶cDNA在P43启动子控制下使用pTTB2系统进行表达，生成了带有和不带有N端His标签的重组质粒。我们评估了两种基于转化能力的转化策略，发现使用SM1/SM2最小培养基进行转化的效率显著高于传统的HS/LS培养基。重组枯草芽孢杆菌克隆在粗蛋白提取物中表现出可测量的芥子酶活性，而非转化的对照菌株则没有活性。不同重组质粒和克隆的酶活性范围为0.316至2.614 U mg?1，且测量结果存在明显差异。SDS–PAGE分析显示蛋白质条带的分子量与芥子酶的预期值（约64.5 kDa）一致，基于亲和力的富集实验也证实了该酶的催化活性。尽管未对酶进行纯化至均一状态，但观察到的活性表明枯草芽孢杆菌可作为生产芥子酶的食品级宿主。本研究为通过菌株工程、分泌策略及下游工艺开发进一步优化这一平台提供了概念验证。
引言
莱菔硫烷是一种由葡萄糖萝卜硫苷水解产生的异硫氰酸酯，因其抗氧化、抗炎和化学预防特性而备受关注，尤其在功能性食品和营养保健品中具有广泛应用[1]、[2]、[3]、[4]。在十字花科植物（如Brassica oleracea var. italica）中，莱菔硫烷的生成依赖于芥子酶（β-硫葡萄糖苷葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.147），该酶在组织受损时催化葡萄糖苷的水解[5]、[6]。芥子酶-葡萄糖苷系统是植物的重要生化防御机制，已在生物学和技术层面得到广泛研究[5]、[7]。
从应用角度来看，可控的莱菔硫烷生产需要可靠的活性芥子酶来源。然而，直接使用植物来源的芥子酶存在诸多限制，包括酶含量低且变化大、加工过程中稳定性差，以及受植物基因型、栽培条件和采后处理方式的影响[7]、[8]。此外，人体肠道微生物群对芥子酶的降解作用也进一步限制了饮食中莱菔硫烷的吸收[9]。这些因素共同制约了植物来源莱菔硫烷生产的可扩展性和重复性。
为克服这些限制，人们探索了微生物异源表达系统作为芥子酶的替代来源。已有研究表明，可以在大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中成功表达西兰花芥子酶[7]、[10]、[11]，但这些宿主在食品和生物技术领域存在一定局限性。大肠杆菌表达芥子酶时容易引发蛋白质错误折叠、溶解度低，且不具备GRAS安全性；而酿酒酵母虽然具有GRAS安全性，但适合真核蛋白生产，但通常生产成本较高，非优化系统的体积产率较低，工艺复杂性较高[12]。
在这种情况下，枯草芽孢杆菌是一个有吸引力的表达平台。这种革兰氏阳性细菌被归类为“一般认为安全”（GRAS）微生物，常用于工业酶的生产[13]、[14]、[15]。其优势包括遗传操作便利、无内毒素产生、生长稳健，以及在食品和生物技术领域的长期安全使用历史。此外，枯草芽孢杆菌具备成熟的基因操作和蛋白质表达技术，以及工业发酵中的良好可扩展性[16]、[17]、[18]。尽管如此，此前尚未有在枯草芽孢杆菌中表达西兰花芥子酶的报道，这可能与植物酶在其天然宿主中的糖基化修饰相关。
重要的是，将枯草芽孢杆菌作为芥子酶生产宿主的目的是为了通过菌株工程、分泌策略和下游工艺开发，实现平台的进一步优化，而非立即超越现有系统的酶产量或活性。因此，即使在粗提物中也能检测到酶活性，这一点对于概念验证至关重要。
在本研究中，我们首次使用基于pTTB2的 constitutive 表达系统，在枯草芽孢杆菌 WEA 中实现了西兰花芥子酶的功能性异源表达。我们评估了基于转化能力的转化策略，证实了重组菌株中的酶活性，并通过亲和力富集验证了蛋白质的产生和活性保留。这些结果为枯草芽孢杆菌作为GRAS兼容的重组芥子酶生产平台提供了概念验证依据，为未来的食品和生物技术应用奠定了基础。
细菌菌株、质粒和培养条件
本实验使用枯草芽孢杆菌 WEA 作为异源表达宿主，表达载体pTTB2在P43启动子控制下实现蛋白质的持续表达[16]。生成了两种重组质粒：pTTB2-myr（编码西兰花芥子酶cDNA）和pTTB2-myr-His（编码带有N端His标签的酶）。
枯草芽孢杆菌通常在37 °C、200 rpm的搅拌条件下于Luria–Bertani（LB）培养基中培养。
在枯草芽孢杆菌 WEA 中建立基于转化能力的转化策略
高效的DNA摄取是枯草芽孢杆菌中异源表达系统成功建立的关键。本研究评估了两种转化策略：传统的HS/LS方法和基于最小培养基的SM1/SM2方法。
结论
本研究首次实现了在具有GRAS安全性的枯草芽孢杆菌中异源表达西兰花芥子酶。通过使用constitutive表达系统和基于转化能力的策略，我们在粗提物中证实了酶活性的可重复性，并验证了蛋白质的产生，其分子量与预期值一致。
CRediT作者贡献声明
Antonio Castillo：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、实验设计、方法学研究、数据分析、概念构建。
Andrea Mahn：负责初稿撰写、数据验证、资源管理、项目协调、资金获取、数据分析、概念构建。
Yarni Pozo：负责数据可视化、方法学研究、实验实施。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢“智利国家科学技术研究基金”（FONDECYT）的资助（项目编号：1201418）。
