通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）以生产肌肌醇（myo-Inositol）和D-旋光肌醇（D-chiro-Inositol）

《Enzyme and Microbial Technology》：Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of myo-Inositol and D-chiro-Inositol

微生物合成D-手性肌醇通过代谢工程优化碳流和关键酶表达，构建工程菌株实现3.39g/L DCI产量，提供绿色生物制造新策略。

　　

刘翔|姬国辉|史峰

教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国无锡214122

摘要

D-手性-肌醇（DCI）是葡萄糖和脂质代谢以及类固醇合成的关键信号分子，在改善人类代谢紊乱方面发挥着重要作用。为了在谷氨酸棒状杆菌中实现DCI的从头合成，通过动态下调pgi、pfkA和zwf基因，改造了肌醇分解代谢受阻的底盘菌株DCI-1。最有效的菌株DPa-1产生了2.89克/升的肌醇（MI），即DCI的直接前体，以及0.83克/升的DCI，其总肌醇产量是对照组的四倍以上。随后，为了促进MI向DCI的转化并供应前体葡萄糖-6-磷酸，过表达了DCI合成所需的关键酶（ino1、iolI₂和iolG）以及葡萄糖转运-磷酸化酶。结合敲除ndnR基因以增强NAD(H)的供应，得到的菌株DPaZbN-3积累了2.82克/升的DCI和2.93克/升的MI。通过在最终改造的菌株DPaZbNMh-3中利用σ?-识别启动子进一步调控肌硫醇合成途径，实现了3.39克/升的DCI和4.12克/升的MI的高效积累，这代表了迄今为止报道的最高微生物DCI生产水平。本研究提供了有效的代谢工程策略和一个强大的微生物平台，用于DCI的绿色生物制造。

引言

肌醇是一种环己烷六醇化合物，存在九种不同的立体异构体，其中最常见且生物学意义最为重要的包括肌醇（MI）、D-手性-肌醇（DCI）和scyllo-肌醇[1]、[2]。MI和DCI这两种重要的异构体广泛存在于生物体内，可以在NAD/NADP依赖的肌醇脱氢酶和肌醇异构酶的催化下相互转化，并协同参与多种生理过程的调节[3]。MI和DCI可以通过谷物、豆类和水果等食物来源摄入，也可以通过内源性途径合成。作为人体内的关键信号分子，DCI在调节胰岛素敏感性、葡萄糖和脂质稳态[4]、[5]以及类固醇生成中起着核心作用。它不仅能够改善多囊卵巢综合征患者的排卵功能和葡萄糖代谢异常[6]、[7]，还表现出多种生理活性，如抗炎作用、胚胎着床调节和类固醇激素平衡维持[8]。因此，DCI在干预代谢和生殖系统紊乱方面具有重要的应用潜力。最近的研究表明，DCI及其衍生物可能在神经系统疾病（例如癫痫）和颗粒细胞肿瘤[10]的辅助治疗中发挥有益作用，进一步扩展了其在生物医学应用中的前景。

目前，DCI的生产主要依赖于化学合成和微生物合成。化学合成通常使用从大豆中提取的D-肌醇[11]作为原料；然而，这种方法存在反应条件苛刻、流程复杂、产率低和严重环境污染等问题，难以满足绿色生产和经济可行性的要求。相比之下，微生物合成由于其环境友好性、广泛的底物范围和可持续性而成为更有前景的替代方案[12]。这种方法主要依赖于肌醇脱氢酶（如IolG）和肌醇异构酶（如IolI）的级联催化，通过酮肌醇中间体将MI转化为DCI（图1）[13]。研究证实，筛选高效酶（如IolI和IolG）可以在谷氨酸棒状杆菌中实现高效的DCI合成。Ji等人通过共表达iolI₂和iolG，成功将20克/升的MI转化为3.21克/升的DCI。通过优化转化条件，在pH 8.0、37°C下添加40克/升的MI后，DCI的产量进一步提高至6.96克/升[14]。此外，Ramp等人通过在代谢工程改造的谷氨酸棒状杆菌中引入NAD?依赖的D-肌醇脱氢酶和NADPH依赖的D-肌醇脱氢酶（来自Medicago truncatula），并增强内源性MI合成途径，实现了1.2克/升的DCI的直接生物合成[15]。最近，Xu等人在酿酒酵母中建立了从头合成DCI的途径，通过重新定向代谢流、构建合成能量系统并表达异源肌醇脱氢酶和肌醇异构酶，从而从葡萄糖中生产出了1.42克/升的DCI和7.32克/升的MI[16]。尽管微生物合成DCI仍面临碳流竞争和需要提高合成效率等挑战，但其不断优化的生物催化能力显示出显著的工业应用潜力。

谷氨酸棒状杆菌是工业生物技术中重要的革兰氏阳性模式微生物。由于其强大的环境适应性、高遗传稳定性、无内毒素和低胞外蛋白酶活性，它被广泛用于高价值化合物（如氨基酸、有机酸和维生素）的工业生产[17]。该菌株拥有从葡萄糖等碳源合成MI和DCI所需的所有基因。由基因ino1/cg3323编码的肌醇磷酸合酶（利用NAD(H)作为辅酶）和由基因impA/cg2298编码的肌醇单磷酸酶催化葡萄糖-6-磷酸（G6P）向MI的转化[18]、[19]、[20]。同时，由多个基因（如iolG/cg0204、oxiD/cg3391）[21]编码的肌醇脱氢酶和由多个基因（如cg0212、cg2312、cg3390）[15]编码的肌醇异构酶可以将MI进一步转化为DCI（图1）。G6P可以通过磷酸转移酶系统（PTS）合成。此外，高亲和力的肌醇转运蛋白IolT1和IolT2（Km值分别为0.22 mM和0.45 mM）[22]能够吸收葡萄糖。这种能力结合葡萄糖激酶（如Glk和PpgK），构成了非PTS途径的葡萄糖吸收和磷酸化[23]、[24]，从而促进了G6P的合成，直接为肌醇合成提供了前体。

然而，野生型谷氨酸棒状杆菌中MI和DCI的内源性合成水平极低，主要是由于以下限制。首先，细胞内产生的MI会被下游分解代谢酶（如IolEDBCJA）迅速降解为乙酰-CoA，进入中央碳代谢途径[22]。此外，由于MI是磷脂酰肌醇和肌硫醇合成所必需的代谢物[25]、[26]，细胞生存对这些物质的固有需求限制了MI的有效积累。第三，作为肌醇合成前体的G6P是葡萄糖代谢中的关键中间产物，自然会流入糖酵解和其他中央代谢途径[27]、[28]、[29]，而不是用于MI的合成，从而进一步加剧了DCI前体供应的不足。第四，由肌醇脱氢酶和肌醇异构酶催化的MI和DCI之间的转化在热力学上倾向于形成MI[21]，使得DCI的显著积累变得困难。

因此，为了解决上述瓶颈并实现DCI的有效从头合成，本研究在谷氨酸棒状杆菌中实施了系统的代谢工程。首先，以谷氨酸棒状杆菌 DCI-1（具有敲除的肌醇分解代谢基因）为初始菌株，通过群体感应（QS）系统或生长调控启动子（GRP）动态下调糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP）中的关键基因，减少了特定生长阶段G6P流向中央代谢的流量，并增加了G6P对MI合成的供应。选择了MI产量较高的菌株，然后过表达了DCI合成途径和非PTS依赖的葡萄糖转运-磷酸化系统中的关键酶。这有效地提高了葡萄糖利用效率和DCI合成能力。此外，通过敲除编码NAD?从头合成基因转录抑制子的ndnR基因，增强了NAD(H)的供应，并通过优化发酵培养基，促进了DCI的积累。最后，通过将MI从DCI合成途径转移到肌硫醇合成的旁路途径，进一步提高了DCI的产量。

菌株和生长条件

本研究中使用的菌株列于表1中。大肠杆菌 JM109被用作质粒构建的宿主。谷氨酸棒状杆菌 DCI-1（之前在我们实验室构建，敲除了与肌醇分解代谢相关的基因[14]）被用作代谢工程和DCI生产的初始菌株。大肠杆菌在LB培养基（10克/升色氨酸、5克/升酵母提取物和10克/升NaCl）中于37°C培养。谷氨酸棒状杆菌在LBB培养基（5克/升色氨酸、2.5克/升

将G6P的碳流重定向到MI和DCI合成途径

在我们之前的研究中，谷氨酸棒状杆菌底盘菌株DCI-1中删除了与肌醇分解代谢相关的基因（如iolEDBCJA（图1）[14]。尽管成功阻断了肌醇分解代谢途径，但该菌株仍未能积累可检测水平的肌醇。推测其内源性肌醇合成途径的效率低下导致前体G6P主要被引入中央代谢途径。为了增强MI的合成，

结论

本研究在谷氨酸棒状杆菌中构建了一个高效的微生物细胞工厂，用于DCI的从头合成。通过系统的代谢工程，首先使用动态调控策略修改了中央碳流，以增强DCI前体MI的合成。随后，通过过表达DCI合成途径和非PTS依赖的葡萄糖转运-磷酸化系统中的关键酶，提高了MI的转化效率。最后，

作者声明

我们，刘翔、姬国辉和史峰，同意将我们的手稿“谷氨酸棒状杆菌的代谢工程用于生产肌醇-肌醇和D-手性-肌醇”提交给《酶与微生物技术》期刊。

刘翔、姬国辉和史峰

教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国无锡214122。

CRediT作者贡献声明

史峰：写作——审稿与编辑，写作——初稿，监督，调查，数据管理。姬国辉：方法学。刘翔：写作——初稿，验证，软件，方法学，数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。