《Experimental Cell Research》：Matrix Stiffness Disrupts Tight Junction Integrity in Retinal Pigment Epithelial Cells via YAP1-Mediated Autophagy Suppression
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基质刚度增加抑制视网膜色素上皮细胞自噬并破坏紧密连接完整性。
王松涛|张宇|杨宁|崔金荣|赵金松
中国长春吉林大学第二医院眼科
摘要
背景
视网膜色素上皮（RPE）细胞的细胞外基质（ECM）在衰老过程中以及病理条件下会逐渐变硬。然而，这些机械效应如何影响RPE细胞的功能尚未完全明了。本研究旨在探讨ECM的硬度对RPE细胞自噬的影响及其在紧密连接中的调节作用。
方法
将ARPE-19细胞培养在低硬度（5 kPa）和高硬度（40 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶基底上。通过Western blotting、定量PCR和免疫荧光染色方法检测紧密连接蛋白和自噬相关标记物的表达及亚细胞定位。使用自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹来药理学地调节自噬，以评估自噬对紧密连接完整性的影响。此外，通过shRNA敲低Yes相关蛋白1（YAP1），以研究其在ECM硬度介导的自噬和紧密连接改变中的作用。
结果
低硬度（5 kPa）和高硬度（40 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶基底对ARPE-19细胞的生长或增殖没有显著影响。高硬度基底显著抑制了ARPE-19细胞的自噬活性，并下调了紧密连接蛋白zonula occludens-1（ZO-1）、Occludin和Claudin-19的表达，导致紧密连接完整性受损。药理学抑制自噬进一步加剧了紧密连接的损伤，而自噬激活部分逆转了高基质硬度引起的紧密连接损伤。此外，敲低YAP1显著减弱了高硬度对自噬和紧密连接蛋白表达的抑制作用。
结论
ECM硬度的增加通过YAP1介导的自噬抑制作用损害了ARPE-19细胞的紧密连接完整性。
部分内容
背景
年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人不可逆视力损伤的主要原因之一，其发病率随年龄增长而显著增加，给全球带来了巨大的社会经济负担1, 2。AMD的发展和进展与遗传易感性、氧化应激、炎症反应以及视网膜色素上皮（RPE）细胞的功能障碍密切相关3, 4, 5, 6。干性和新生血管性AMD都涉及RPE细胞的损伤
细胞培养
人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞（ATCC，美国）在含有10%胎牛血清（FBS，Pricella，中国）的DMEM/F12培养基中培养，培养条件为37°C和5% CO2。当细胞达到80%汇合度时进行传代。
制备不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶
通过调整丙烯酰胺与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的比例来制备不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶（PAAGs）。加入过硫酸铵（APS）和N,N,N,N'-四甲基乙二胺（TEMED）以引发聚合反应
制备不同硬度的基底
为了模拟RPE细胞所经历的ECM硬度，根据TSE等人的方案制备了不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶。具体制备了硬度分别为5 kPa和40 kPa的水凝胶。进一步评估了这些水凝胶的潜在细胞毒性。如图1A所示，ARPE-19细胞在24小时、48小时和72小时培养在不同硬度的水凝胶上时表现出相似的形态特征和生长模式。
讨论
基质硬度是细胞外微环境中的一个关键机械信号，在调节细胞形态、增殖、迁移和分化中起着重要作用[31]。虽然长期以来人们对Bruch膜的结构性重塑重视不足，但它是衰老和疾病进展过程中一个公认的病理过程。胶原沉积的逐渐增加、弹性纤维的断裂和钙化导致RPE周围基质的硬度显著升高
结论
本研究表明，基质硬度的增加抑制了ARPE-19细胞的自噬并破坏了紧密连接的完整性，这表现为ZO-1、Occludin和Claudin-19的表达减少和定位紊乱。从机制上看，基质硬度的升高促进了YAP1的激活和核转位，从而导致自噬抑制。在硬度较高的条件下，通过遗传或药理学手段恢复自噬可以部分恢复紧密连接结构。这些发现
作者贡献声明
王松涛：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。赵金松：审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金争取、概念构思。崔金荣：审稿与编辑、数据可视化、数据分析。杨宁：审稿与编辑、方法学设计、实验实施。张宇：审稿与编辑、方法学设计、实验实施
伦理批准和参与同意
不适用
数据可用性声明
如需，可从通讯作者处获取本研究的数据。
资助
本研究得到了吉林省科学技术发展计划（项目编号：YDZJ202501ZYTS710）的支持。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
