如何利用杆状病毒系统成功表达昆虫微粒体P450蛋白

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：How to successfully express insect microsomal P450 using a baculovirus system

本研究开发了基于bac-to-bac系统的昆虫细胞P450酶高效表达新方法，提出CPR平衡与P450点两大核心策略，显著提升酶活性与表达稳定性。通过白粉虱（Bemisia tabaci）CYP4C64、CYP6DZ7和CYP6CM1三个关键酶验证，证实该方法适用于多亚家族P450表达，并附详细操作手册。

　　

作者：卢汉堂、程文翰、张成家、拉尔夫·瑙恩、克里斯·巴斯、张友军、巴特洛米耶·J·特罗茨卡、杨欣

中国科学院蔬菜花卉研究所植物保护系蔬菜生物育种国家重点实验室，北京100081，中国

摘要

Cytochrome P450酶（P450s）在多种外源化合物的代谢中起着关键作用。在昆虫体内，它们通常参与许多杀虫剂的I相代谢，这可能导致抗性的产生。对这些P450s的研究经常使用昆虫细胞系中的异源表达来进行体外功能表征。然而，确定昆虫P450s表达的最佳条件具有挑战性。在这里，我们通过引入两个新概念——“CPR平衡”和“P450点”，开发了一种改进的昆虫P450s在昆虫细胞系中表达的方案。通过调整CPR/P450病毒的滴度，实现了微粒体P450在细胞系统中的稳定表达；通过建立H5细胞病毒感染的时间梯度，确定了P450收获的最佳时间点。这两个改进提高了P450体外表达的可操作性，并增加了活性P450的含量。利用来自农业害虫银叶粉虱（Bemisia tabaci）的三种P450，我们证明了该方案在体外表达活性P450蛋白方面是高效且稳定的，并且适用于不同亚家族的多种CYPs。此外，详细的步骤指南包含在附录中。我们的工作为昆虫P450s的真核表达提供了改进的参考，将有助于未来使用bac-to-bac系统的体外表达研究。

引言

Cytochrome P450单加氧酶（P450s）是最大和最多功能的酶超家族之一，在不同物种的内源底物和外源物质的代谢中起着关键作用（Guengerich, 2008; Nelson, 2018）。在害虫管理中，P450s因参与内源性化合物（如植物次生代谢物）和化学杀虫剂的解毒而受到特别关注（Feyereisen, 1999; Manjon et al., 2018）。事实上，昆虫P450s已被证明会促进对天然和合成杀虫剂的抗性进化（Bass and Nauen; Dermauw et al., 2020）。其中，CYP家族成员因其代谢多种杀虫剂的能力而被广泛记录（Feyereisen, 2012; Xie et al., 2018）。新烟碱类杀虫剂因其强毒性和杀虫效果而成为控制粉虱的主要手段（Palumbo et al., 2001）。其中，吡虫啉（IMI）是过去几十年中第一个商业化并最广泛使用的此类杀虫剂（Bass et al.）。然而，随着其应用范围和时间的延长，粉虱对IMI的抗性日益增加，成为害虫管理中的一个重大挑战。了解P450介导的IMI解毒的分子机制对于有效的抗性管理至关重要（Karunker et al., 2008）。

昆虫P450的研究经常使用昆虫细胞系中的异源表达来生成重组蛋白以进行功能表征，例如代谢杀虫剂的能力（Li et al., 2007; Stevenson et al., 2012）。然而，昆虫P450的体外表征在技术上仍然具有挑战性（Nauen et al., 2021），包括辅因子的整合以及与电子转移伙伴（如NADPH-cytochrome P450还原酶（CPR）的相互作用以维持催化活性（Li et al.; Iyanagi et al., 2012; Li et al.; Nauen et al., 2022）。使用常见的表达系统（如大肠杆菌（Escherichia coli）和酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞系）生产功能性P450蛋白的过程往往无法再现昆虫P450所需的天然构象和翻译后修饰，导致产量低、膜定位不正确或蛋白质失活（Gonzalez and Korzekwa; Jiang et al.; Waterman, 1993）。为了解决这些问题，人们寻求更接近昆虫细胞生理环境的异源表达系统作为传统表达系统的替代方案（Feyereisen, 1999; Jarvis, 2009）。在Spodoptera frugiperda（Sf9）和Trichoplusia ni High Five细胞（H5）中使用的杆状病毒到杆状病毒?表达系统（Bac-to-Bac）因其与真核生物翻译后机制的兼容性和支持高密度培养的能力而成为首选策略（Bass et al., 2013; Emery, 1992; Karunker et al., 2009）。然而，Bac-to-Bac表达系统仍面临一些问题，如CPR的亚最优共表达（Murataliev et al., 2008）、酶稳定性低（Guengerich, 2004）以及批次间催化活性不一致（Guengerich, 2008; Munro et al., 2007）。此外，CYPs之间的结构差异、优化多重感染（MOI）的耗时过程（Cronin, 2023）以及细胞密度导致的活性降低（Bernal et al., 2009），进一步阻碍了昆虫P450生产在生化测定中的可重复性和可扩展性。所有这些问题都严重妨碍了昆虫学和杀虫剂研究人员对P450s进行体外功能表征的研究。

为了解决这些问题，我们改进了使用bac-to-bac表达系统高效表达昆虫P450的方案，并使用来自B. tabaci的三种微粒体P450进行了验证，这些P450与多种杀虫剂的抗性有关。其中包括CYP4C64，它赋予对噻虫嗪的抗性（Yang et al., 2021）；CYP6DZ7，它与吡虫啉、噻虫嗪和氰traniliprole的抗性有关（Barman et al., 2022）；CYP6CM1，它对多种杀虫剂具有广泛的活性，特别是新烟碱类杀虫剂，如吡虫啉（Jones et al., 2011; Karunker et al., 2009; Roditakis et al., 2011）、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒（Hamada et al., 2019）、尼丁吡胺（Pym et al.）。这三种P450都被认为在粉虱体内具有强大的解毒和代谢能力。

与传统的杆状病毒表达系统相比，我们的方案引入了几项关键创新。首先，引入了关于P450表达条件的两个新概念：“CPR平衡”和“P450点”。“CPR平衡”从表达系统稳定性的角度改善了电子传递链的组成（Murataliev et al., 2008）；“P450点”根据P450的表达时间控制代谢毒素在系统内的积累（Ikonomou et al., 2003）。其次，优化了5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（ALA）和柠檬酸亚铁的浓度，以维持P450表达的最佳环境条件（Guengerich, 2008）。此外，我们提供了一个评估P450表达阶段的参考时间线，有助于明确确定P450表达的阶段。最后，我们提供了关于昆虫P450体外表达的详细操作手册。

实验步骤片段

细胞色素P450基因的鉴定和PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen, USA）从成年粉虱（50只混合性别成虫）中分离总mRNA。使用NanoDrop 2000c（USA）测量mRNA的纯度和产量。然后使用oligo (dT) 18引物和SuperScript II逆转录酶进行RNA逆转录，该酶包含集成的基因组DNA去除步骤（Takara, Japan）。首先鉴定出三种细胞色素P450（CYP4C64、CYP6CM1和CYP6DZ7）和细胞色素P450还原酶（BtCPR）的开放阅读框（ORFs）

最佳表达条件的探索

为了开发改进的昆虫细胞系中P450表达的方案，我们对传统bac-to-bac方案的某些步骤进行了调整和优化。我们的目标是确定P450活性和蛋白产量的最佳实验条件。首先，我们通过实验测试了不同比例的P450和CPR病毒，并在不同时间点监测了重组酶的功能完整性和血红素结合情况。然后我们评估了...

讨论

Cytochrome P450在昆虫对外源物质的适应过程中起着关键作用。为了证明P450在抗性研究中的因果作用，重要的是要在体外证明其代谢杀虫剂的能力。然而，昆虫细胞色素P450的体外表达具有挑战性，特别是确保P450蛋白在体外环境中保持酶活性。在这里，通过研究研究较为充分的粉虱B. tabaci的P450基因，我们提出了两个新的...

结论

体外P450表达系统的改进对于推进杀虫剂抗性和解毒途径的研究具有重要意义。然而，必须承认我们的研究是在他人研究的基础上进行的。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在异源P450表达中发挥了核心作用：这种Tn7介导的转座系统使得在E. coli中生产重组bacmids成为可能，然后将其用于感染昆虫细胞以产生蛋白质...

CRediT作者贡献声明

杨欣：监督、概念设计。巴特洛米耶·J·特罗茨卡：撰写——审阅与编辑、概念设计。张友军：监督、项目管理、资金获取。拉尔夫·瑙恩：撰写——审阅与编辑。克里斯·巴斯：撰写——审阅与编辑。程文翰：验证。张成家：验证。卢汉堂：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、正式分析、数据管理

未引用参考文献

Bass et al., 2015; Bass and Nauen, 2023; David et al., 2013; Dermauw et al., 2020; Ducharme et al., 2021; Gonzalez and Korzekwa, 1995; Jiang et al., 2021; Kemper, 2004; Li et al., 2004; Pym et al., 2023; Riddick et al., 2013.

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32361133558、32221004、32272598）、中国农业研究系统（CARS-24-C-02）、中央公益性科学机构基础研究基金（Y2023XK15; Y2024XK01）以及北京蔬菜害虫控制与可持续栽培重点实验室和农业科学技术创新计划（ASTIP）的支持。