《Chemical Engineering Journal》：Receptor-engineered biosensor coupled with thiol-reactive probes for detecting androgen agonists and antagonists
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可靠区分雄激素受体（AR）激动剂与拮抗剂对内分泌干扰物筛查至关重要。本研究通过分子动力学模拟和ABACUS蛋白设计，在AR结合域12螺旋区引入半胱氨酸突变，并利用5-IAF荧光探针实现特异性标记。优化后的荧光生物传感器显示激动剂DHT结合仅引起轻微荧光下降，而拮抗剂Flutamide导致荧光显著减弱，非目标化合物无响应。验证表明该传感器能有效区分环境和食品基质中的AR激动/拮抗剂，为快速检测提供新工具。
宁莉|刘凌飞|冯一宁|任晨曦|郑向峰|胡秦|杨振全|肖丽霞|关天柱
扬州大学食品科学与工程学院，中国扬州225127
摘要
在食品安全评估和环境监测中，可靠地区分雄激素受体（AR）激动剂和拮抗剂对于检测内分泌干扰物至关重要。本文开发了一种基于荧光的生物传感器，该传感器利用配体诱导的AR配体结合域（LBD）内的构象变化。通过分子动力学模拟结合ABACUS蛋白质设计方法，将半胱氨酸突变引入AR_LBD的关键螺旋12区域，从而实现5-碘乙酰胺荧光素的特异性荧光标记。优化后的受体工程化生物传感器在结合激动剂二氢睾酮时表现出轻微的荧光减弱，而拮抗剂氟他胺的结合则导致荧光强度显著下降。特异性验证表明，非目标化合物不会引起传感器的任何可检测的荧光变化。此外，实际应用测试证实了该生物传感器能够可靠地检测和区分环境和食品基质中的AR激动剂和拮抗剂。这种生物传感器能够快速且可靠地区分AR激动剂和拮抗剂，适用于食品安全和环境监测。
引言
雄激素受体（AR）激动剂（如二氢睾酮）和拮抗剂（如氟他胺）通过雄激素受体信号通路调节重要的生理过程[7]、[25]。AR介导的信号通路失调与多种病理生理状况及生态扰动密切相关。因此，准确检测AR激动剂和拮抗剂对于监测食品和环境样本中的内分泌干扰物（EDCs）至关重要。传统的检测AR配体的方法包括报告基因测定和基于细胞的增殖测定[23]、[31]。Pang等人利用基于对接的虚拟筛选策略结合基于细胞的eGFP和PSA读数，通过体外测定鉴定了新的AR拮抗剂并区分了其激动效应和拮抗效应[22]。Garoche等人开发并验证了一种使用稳定的UALH-hAR报告细胞系的体外转录激活测定方法，用于筛选AR激动剂和拮抗剂[9]。最新研究显示，一种新型的高性能薄层色谱-酵母生物测定法可以有效区分复杂实际样本中的激动剂和拮抗剂活性[13]。然而，这些传统方法往往缺乏足够的速度、特异性或可靠区分激动剂和拮抗剂的能力。因此，开发利用AR结构特征的创新生物传感器十分必要。
AR的配体结合域（LBD），特别是螺旋12（H12）区域，会根据结合配体的性质发生不同的构象变化。研究表明，激动剂结合会稳定H12的活性构象，而拮抗剂结合则会导致其重新定位，从而阻止共激活剂的结合[27]。Albuquerque等人发现激动剂能稳定H12的活性构象，而拮抗剂则会取代H12并阻碍共激活剂的结合[2]。拮抗剂结合还会破坏H11的C端，从而阻止H12的正确折叠并阻断雄激素受体的激活[6]。Azhagiya Singam等人证明拮抗剂结合会导致H12显著位移，有效阻断其转录激活能力[4]。同样，Tan等人开发了一种基于雌激素受体的生物传感器，该传感器结合了构象特异性荧光报告剂，根据配体诱导的结构变化区分雌激素激动剂和拮抗剂[28]。另一项研究报道，基于BRET的构象生物传感器能够高效检测G蛋白偶联受体（GPCRs）中由激动剂和反向激动剂引起的结构变化[26]。这些配体诱导的H12动态变化为开发利用结构差异有效分类AR配体的检测方法提供了可靠的框架。
巯基反应性荧光探针提供了一种将蛋白质构象变化转化为可检测光学信号的有前景的策略。它们通过共价结合到半胱氨酸残基上，能够报告局部极性或溶剂暴露的微妙变化，从而实现精确检测配体诱导的构象变化[11]、[33]。最近的研究表明，新型马来酰亚胺偶联的GFP-发色团类似物是有效的巯基反应性探针，可用于检测GPCRs中的配体诱导的结构变化[5]。Hibbs等人使用丙烯酰丹偶联的半胱氨酸突变技术检测乙酰胆碱结合蛋白中的配体诱导的构象变化[12]。类似地，NBD偶联的荧光探针也被证明能有效监测hERG钾通道中的配体诱导的构象变化[16]。这些发现强调了巯基反应性探针在高效区分配体特异性构象变化方面的潜力。
本研究提出了一种基于荧光的新型生物传感器，该传感器利用AR_LBD中的配体诱导的结构变化来有效区分激动剂和拮抗剂。整体检测策略如图1所示。我们通过分子动力学（MD）模拟分析了AR_LBD中的配体诱导的构象转变。通过计算蛋白质设计将半胱氨酸替换引入H12区域，并用5-碘乙酰胺荧光素（5-IAF）标记，以区分激动剂和拮抗剂。这种策略提供了一个快速且选择性的AR配体检测平台，在内分泌干扰物筛查、食品安全评估和环境监测中具有巨大潜力。
材料与试剂
携带AR_LBD_1和AR_LBD_2的pET-32(a)质粒由苏州金威智生物公司合成。PVDF膜、氨苄西林、His标签蛋白纯化试剂盒（耐变性剂）、30% Acr-Bis、TEMED、BeyoECL Plus和BeyoColor?预染色蛋白质分子量标准品均来自Beyotime生物技术有限公司。抗6×His兔多克隆抗体、异丙基-β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）、二甲基亚砜（DMSO）和Novel One Step Western Blot（WB）试剂盒（兔用）也来自该公司。
AR_LBD中半胱氨酸突变的分析
为防止巯基反应性探针与AR_LBD中的天然半胱氨酸残基发生非特异性相互作用，进行了定向突变以消除五个天然存在的半胱氨酸残基（C686、C784、C806、C844和C852）。工程化的氨基酸序列列于表S1中，相关的能量变化见表S2。所有设计序列都在AR_LBD的天然半胱氨酸残基处包含突变。R1_LBD显示出较低的S1、S2和PACKING值。
结论
总之，我们成功开发并验证了一种高灵敏度和选择性的基于荧光的生物传感器，该传感器利用AR配体诱导的构象变化。通过ABACUS蛋白质设计平台，将半胱氨酸残基策略性地引入AR_LBD，使其在与AR激动剂和拮抗剂相互作用时产生不同的荧光响应。该生物传感器表现出优异的特异性，且几乎不受各种非目标化合物的干扰。
CRediT作者贡献声明
宁莉：撰写——原始草稿、验证、研究。刘凌飞：验证、研究、数据分析。冯一宁：验证、研究、数据分析。任晨曦：验证、研究、数据分析。郑向峰：验证、研究、数据分析。胡秦：指导、数据管理。杨振全：指导、数据管理。肖丽霞：指导、数据管理。关天柱：资金获取、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32372368）、新疆天然药用和食用植物资源化学实验室（喀什大学（KSUZDSYS202305）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX23_3561）的支持。
