《Chemical Engineering Journal》：Azo dye self-assemblies for targeted two-photon phototherapy of colorectal cancer
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两光子光动力疗法（TP-PDT）通过偶氮基光敏剂（PS）与RGD肽共组装形成靶向αvβ3整合素的纳米颗粒（NPs），增强结直肠癌细胞选择性光毒效应并减少正常组织损伤。该PS采用简单偶氮耦合反应合成，自组装为稳定水溶性的NPs，具有高效一型ROS生成和精准肿瘤组织识别能力，为早期结直肠癌诊疗提供创新策略。
Pallavi Anil Kasar|Dhananjay Nandkumar Bhalerao|Jong Beom Kang|Vinayak Juvekar|Kil Ho Lee|Hyuk Kang|Tae Jun Park|Sung Jae Shin|Hwan Myung Kim
韩国水原市Ajou大学化学系与能源系统研究系，邮编16499
摘要
双光子光动力疗法（TP-PDT）通过产生活性氧（ROS）来选择性地杀死肿瘤细胞，为癌症治疗提供了一种靶向、微创的方法。在本研究中，我们开发了一种不含重原子的偶氮基光敏剂（PS），并将其与RGD（Arg-Gly-Asp）肽共组装，以实现针对αvβ?整联蛋白的递送。这种通过简单偶联反应合成的PS能够自组装成纳米颗粒（NPs），具有优异的胶体稳定性、明确的发射特性以及增强的I型ROS生成效率。实验结果表明，这些NPs能够优先被癌细胞摄取，并对结直肠癌细胞表现出强烈的光毒性，同时对正常细胞的影响较小。值得注意的是，将TP-PDT应用于人类结直肠活检样本时，发现这些NPs能够区分恶性组织和健康组织，实现选择性肿瘤消融。总体而言，这些发现突显了将TP-PDT与偶氮染料结合作为结直肠癌早期检测和治疗先进策略的潜力。
引言
结直肠癌（CRC）仍然是全球主要的健康问题之一，是导致癌症相关死亡的主要原因之一。早期识别CRC可以通过及时进行手术治疗显著提高生存率[1]、[2]、[3]。然而，晚期CRC常伴有转移，这使得治疗变得复杂，生存率降低。尽管化疗和靶向治疗取得了显著进展，但仍迫切需要新技术来改善患者预后[4]、[5]、[6]。
双光子光动力疗法（TP-PDT）利用光激活的光敏剂产生活性氧（ROS），从而实现对癌细胞的靶向破坏，同时对正常组织的损伤最小。与化疗和放疗相比，PDT已被证明能降低全身毒性，是癌症治疗的一种有前景的方法[7]、[8]、[9]、[10]。TP-PDT的整体效果在很大程度上取决于光敏剂（PS）的特性[7]、[8]、[9]、[11]。传统的PS（如卟啉）在肿瘤选择性方面有限，且容易在非靶组织中积累，导致不必要的毒性。此外，其平面和疏水分子结构容易在水溶液中聚集，从而降低荧光信号和ROS生成。因此，开发具有增强肿瘤选择性的下一代PS至关重要[12]、[13]、[14]、[15]。
基于纳米颗粒的靶向TP-PDT是一种有效策略，可以通过提高光敏剂的溶解性和稳定性来改善其递送和性能，同时抑制聚集引起的ROS生成损失[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。在靶向PDT中，选择性配体-受体相互作用并非作为诊断终点，而是用于空间限制ROS生成并提高治疗选择性。因此，靶向特异性在提高局部光动力效果的同时，对于减少脱靶光毒性至关重要。在这方面，越来越多的研究关注结合人体相关实验平台的临床前评估策略，以在早期阶段评估靶向效果和治疗结果[22]。
在各种靶向策略中，RGD（Arg-Gly-Asp）肽因其对αvβ3和αvβ5整联蛋白的高亲和力和选择性而受到广泛关注，这两种整联蛋白在肿瘤细胞和肿瘤新生血管中通常过度表达[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。这种配体-受体相互作用能够促进治疗或诊断剂在肿瘤组织中的积累和更深层次的渗透。整联蛋白作为跨膜受体，在介导细胞-细胞外基质（ECM）相互作用和调节关键细胞活动中起着关键作用。已知有八种整联蛋白异二聚体能够特异性结合RGD基序，其中αvβ3和αvβ5通过ECM结合促进肿瘤细胞黏附和血管生成[29]、[30]、[31]。因此，开发针对整联蛋白的纳米颗粒（NPs）对于提高PS负载NPs在恶性细胞中的选择性结合和摄取具有重要意义[32]。
在我们之前的研究中，我们介绍了一类新型的偶氮桥接、环化的花青素光敏剂，它们能够通过双光子激活并主要通过I型光动力机制生成ROS[33]。尽管这些PS表现出有希望的光物理性质和高效的ROS生成能力，但其阳离子性质限制了在水环境中形成稳定的自组装纳米结构。为克服这一限制，我们设计并合成了一种具有两亲性结构的中性推拉染料，旨在改善自组装行为，同时保持有效的光动力性能。
在本研究中，我们旨在开发一种不含重原子的偶氮基光敏剂，将其与DSPE-PEG2k-lRGD共组装，用于αvβ3整联蛋白靶向的TP-PDT，以解决传统PDT系统的主要局限性，这些系统依赖于重原子的引入、单光子激发或主要局限于细胞水平评估[34]、[35]。作为光敏剂，我们选择了2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚烯)马来腈（TCF）作为电子受体，因为它具有强的分子内电荷转移（ICT）特性和宽的可见光到近红外吸收范围[36]。值得注意的是，基于环化TCF的光敏剂在TP-PDT分子工程中尚未得到充分研究。我们假设将这种环化TCF框架与纳米颗粒自组装和αvβ3靶向递送相结合，可以实现高效的双光子激活和以I型ROS生成为主。因此，本工作重点关注BCC-P4-lRGD NPs的分子设计、光物理性质和生物学评估，并系统地评估了它们在体外和体外结肠癌模型中的双光子诱导光动力性能。
合成、表征和光物理研究
含偶氮的环化三氰呋喃（TCF）基PS BCC-P4是通过BCC染料衍生的重氮盐与PEGylated N,N-二甲苯胺单元之间的简单偶联反应合成的（图1a）。BCC染料是通过使用SnCl?·2H?O作为还原剂，对(E)-2-(5-(2-(1,3-二氧杂环烷-2-基)乙基)-4-(4-叠氮-2-羟基苯乙烯基)-3-氰基-5-甲基呋喃-2(5H)-亚烯进行还原环化得到的。
结论
总之，我们开发了一种新型的不含重原子的偶氮桥接光敏剂（BCC-P4），它具有内在的两亲性，并与RGD基序共组装，形成了针对αvβ?整联蛋白的纳米颗粒。这种合理的设计提高了PS在水中的分散性，使得在自组装纳米结构中能够实现高浓度的PS，从而通过αvβ?整联蛋白的过表达实现肿瘤细胞的靶向。广泛的体外实验证实了这一点
CRediT作者贡献声明
Pallavi Anil Kasar：撰写原始草稿、进行研究、数据管理。Dhananjay Nandkumar Bhalerao：撰写原始草稿、进行研究、数据管理。Jong Beom Kang：进行研究。Vinayak Juvekar：进行验证、进行研究。Kil Ho Lee：进行研究。Hyuk Kang：进行研究。Tae Jun Park：进行研究、数据管理。Sung Jae Shin：进行验证、数据管理。Hwan Myung Kim：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由科学技术信息通信部（Ministry of Science and ICT）支持（项目编号：RS-2025-24534195），以及基础科学研究计划（Basic Science Research Program）的支持（项目编号：RS-2021-NR060141）。人类结直肠肿瘤和正常组织样本的获取遵循赫尔辛基宣言的伦理原则，并得到了Ajou大学医院机构审查委员会的批准（批准编号：AJOUIRB-KS-2022-381和AJOUIRB-SM-2025-502）。
