EGFR靶向特异性纳米抗体的筛选与表征

《Protein Expression and Purification》：Screening and characterization of EGFR-targeted specific nanobodies

EGFR外显体结构制备及纳米抗体筛选研究：利用哺乳动物表达系统成功制备带Avi标签的EGFR外显体，通过噬菌体展示技术结合多轮生物淘洗和多种生物化学方法（包括BLI和EGF竞争实验），鉴定出高亲和力纳米抗体NB1B3，其与EGF存在竞争结合表型，为后续抗EGFR纳米抗体开发奠定基础。

　　

Jing Geng|Long Sha|Yan Liu|Yingjun Wang|Shuaiying Zhao|Jianfeng Xu

上海海洋大学食品科学与技术学院，201306，上海，中国

摘要

表皮生长因子受体（EGFR），也称为HER1或ErbB1，是ErbB受体家族的成员。它在表皮生长因子（EGF）介导的细胞增殖和信号转导途径中起着关键作用。EGFR的突变或过表达与多种实体瘤的发生和发展密切相关，因此成为肿瘤靶向治疗的重要分子靶点。在本研究中，我们使用带有C端Avi标签的真核表达系统制备并纯化了EGFR的胞外域，并将其作为生物素化抗原用于噬菌体展示筛选和后续的生化分析。利用我们实验室先前构建的抗EGFR骆驼类免疫纳米体库，通过噬菌体展示技术对纯化的EGFR胞外域进行了生物淘选。通过噬菌体ELISA、序列分析、可溶性表达筛选和进一步的生化表征，鉴定出几个具有特异性结合EGFR的纳米体候选物。其中，代表性克隆NB1B3通过ELISA、生物层干涉测量（BLI）和EGF竞争实验进行了深入分析。基于BLI的结合动力学显示该克隆具有纳摩尔级的亲和力，而竞争性ELISA则证明了其在体外能够有效竞争EGF的结合位点，表明其具有潜在的抑制功能。综上所述，这些结果确定了NB1B3作为一个具有初步生化证据的EGFR结合纳米体候选物。尽管其精确表位和细胞活性仍有待确定，但本研究为进一步的抗EGFR纳米体开发提供了实验支持。

引言

EGFR是一种属于ErbB受体家族的跨膜蛋白[1,2]。其结构包括一个胞外配体结合域、一个跨膜螺旋和一个胞内酪氨酸激酶域。在人类中，ErbB家族由四个成员组成：EGFR（ErbB1/HER1）、ErbB2（HER2）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4）[3]。EGFR位于细胞表面，在与特定配体（如表皮生长因子（EGF）和转化生长因子-α（TGF-α）结合后被激活。激活后，EGFR会启动下游信号级联反应，主要涉及MAPK和Akt通路，这些通路调节包括增殖、迁移、分化和存活在内的关键细胞过程[4]。在许多癌症中，EGFR的功能经常因过表达或特定的基因改变而失调。例如，在一部分非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，EGFR基因的激活突变导致持续的酪氨酸激酶活性[5]，从而产生独立的配体依赖性增殖信号。同样，EGFR过表达在乳腺癌中也很常见，并与较差的预后相关[6]。异常的EGFR信号传导也参与了胶质母细胞瘤[7]、胰腺癌和其他实体瘤的发病机制。作为细胞信号网络中的核心节点，EGFR在肿瘤发生中起着关键作用，使其成为分子靶向抗癌疗法的主要靶点。

EGFR是一种分子量约为170 kDa的跨膜糖蛋白，在细胞表面广泛表达[4]。当与其配体结合时，EGFR会发生构象变化，从单体状态转变为活性二聚体形式。二聚化随后触发受体胞内域中特定酪氨酸残基的自磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基作为结合位点，招募各种适配蛋白和下游信号分子。被招募的适配蛋白进一步启动多种复杂的下游信号级联反应，主要包括RAS-RAF-MEK-ERK（MAPK）通路、PI3K-AKT-mTOR通路、JAK-STAT通路和PLCγ-PKC通路[4,8]。通过这些相互连接的网络，细胞外的生长刺激信号被传递到细胞核，最终调控特定基因的转录，驱动增殖和分化等关键细胞过程。

目前，针对EGFR的治疗药物主要分为两大类。第一类是最常用的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如Gefitinib[9]、Afatinib[10]和Osimertinib[11]，它们已显示出显著的临床疗效。第二类是单克隆抗体药物，以Cetuximab[12]为代表。尽管这些药物具有临床优势，但耐药性的出现仍然是EGFR靶向治疗的主要挑战。

纳米体，也称为VHH抗体或单域抗体，来源于骆驼类动物天然存在的重链可变域[13]。由于体积小[14,15]、高特异性、稳定性好[16]以及组织穿透能力强，纳米体已成为生物医学研究和治疗开发中的强大工具。

在过去的二十年里，采用了多种免疫和筛选策略来生成针对EGFR胞外域的纳米体[17,18]。这些研究不仅证明了使用纳米体作为EGFR靶向剂的可行性，还提供了重要的结构和功能见解。然而，大多数先前报道的抗EGFR纳米体主要是基于结合亲和力进行选择的，其功能特性（如阻断配体-受体相互作用的能力）大多尚未得到充分研究[19,20]。此外，早期研究中用于免疫的抗原通常来自原核表达系统或商业来源，可能无法完全保留EGFR胞外域的天然构象和翻译后修饰。

在本研究中，我们制备了一种携带C端Avi标签的哺乳动物表达EGFR胞外域，用作生物素化筛选抗原和检测试剂。然后使用该胞外域抗原对先前生成的EGFR导向免疫纳米体库进行了噬菌体展示筛选。通过噬菌体ELISA、序列分组和可溶性表达筛选，以及后续的直接ELISA、梯度ELISA、BLI和EGF竞争实验，鉴定出阳性克隆。这项工作的目标不是开发首个抗EGFR纳米体，而是识别并表征一个在体外具有配体竞争表型的EGFR结合纳米体候选物，为未来的细胞和机制研究提供起点。

部分摘要

EGFR的构建、表达和纯化

编码EGFR胞外域（氨基酸1-645）的DNA序列被克隆到一个含有C端FLAG标签的CMV表达载体中，并进一步引入了Avi标签（GLNDIFEAQKIEWHE）序列以实现位点特异性生物素化。构建的质粒通过聚乙二醇胺（PEI）转染到293F悬浮细胞中。转染时，细胞密度调整为约2.4 × 10⁶细胞/mL。转染后，细胞被培养

EGFR的表达和纯化

用于筛选的抗原是通过构建编码人类EGFR胞外域（氨基酸1-645）的重组质粒生成的。该基因片段被克隆到一个CMV驱动的表达载体中，产生一个带有C端Avi标签（GLNDIFEAQKIEWHE）和FLAG标签的融合蛋白（质粒图谱见图1A）。表达的蛋白质通过亲和层析和大小排阻层析（使用HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱）进行纯化。

结论

在本研究中，通过多轮生物淘选和噬菌体展示技术，从一个高多样性免疫库中分离出了特异性针对EGFR胞外域的单克隆纳米体。通过基于ELISA的筛选，鉴定出几个对EGFR具有强结合亲和力的阳性克隆。随后选择了一个具有最高结合活性的代表性克隆进行深入表征。

通过梯度ELISA和BLI分析，鉴定出一种高亲和力的纳米体NB 1B3。

CRediT作者贡献声明

Jing Geng：撰写——原始草稿、可视化、方法学设计、实验设计、数据整理、概念构建。Long Sha：软件开发。Yan Liu：实验实施。Yingjun Wang：实验实施。Shuaiying Zhao：数据分析。Jianfeng Xu：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金获取。

致谢

骆驼免疫、纳米体（Nb）库的生成、筛选和鉴定工作由上海凯洛生物科技有限公司完成。本工作得到了上海凯洛生物科技有限公司的资助。