叶片的成熟度如何影响其性能？一项关于幼叶和成熟叶胶艾桉（Eucalyptus globulus）精油在作物保护中的比较研究

《Pest Management Science》：How does leaf age affect performance? A comparative study of essential oils from young and mature Eucalyptus globulus leaves in crop protection

　　**摘要**

**背景**
来自蓝桉（Eucalyptus globulus Labill.）叶片的精油因其生物活性而广受认可。然而，叶片年龄对精油化学成分和生物活性的影响仍不清楚。本研究旨在表征从幼树叶片（YEEO）和成熟树木叶片（AEEO）提取的精油的化学成分及其对相关农业害虫和病原体的生物杀虫潜力。

**结果**
代谢组分析显示，YEEO和AEEO之间的化合物多样性总体相似。YEEO含有较高水平的α-蒎烯和β-蒎烯，而AEEO则富含氧合化合物，如1,8-桉叶油醇和反式蒎叶醇。通过枯苗前和枯苗后试验测试了这两种精油的除草活性，结果显示在最高浓度下对Portulaca oleracea和Solanum nigrum具有强烈的杀草效果，死亡率达到100%。两种精油还表现出剂量依赖性的抗菌活性，其中Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis最敏感，其次是Xanthomonas euvesicatoria和Pseudomonas syringae pv. tomato。尽管未观察到对Alternaria alternata或Botrytis cinerea的抗菌活性，但两种精油对Phthorimaea absoluta幼虫显示出强烈的杀虫活性，在最高浓度下可实现完全杀灭（YEEO的LC50为15.2% v/v，AEEO的LC50为14% v/v），LC90值分别为41.4% v/v和38.5% v/v。

**结论**
尽管化学成分存在差异，YEEO和AEEO仍表现出相当的除草、抗菌和杀虫效果，这突显了大规模生产精油的可行性，尤其是通过利用造纸和家具行业产生的副产品——成熟叶片。这些发现表明蓝桉精油作为对抗杂草、昆虫和细菌的生物活性剂的潜力；然而，需要进一步的田间研究来评估其实际应用性。

**1 引言**
几个世纪以来，植物一直被认为是具有药用、工业和农业价值的生物活性化合物的来源。其中，原产于澳大利亚东南部并在全球广泛栽培的蓝桉（Eucalyptus globulus Labill.），因其精油而具有重要意义，尤其是其治疗、解充血、抗炎、镇痛和抗氧化特性对健康有明显益处。此外，蓝桉精油还具有抗菌、抗真菌、杀虫和除草作用。这些特性使蓝桉精油成为可持续作物保护的理想候选物，因为它们具有广谱活性且对环境影响小。与传统农药不同，后者通常针对单一代谢途径，容易导致抗性增加，而精油含有多种具有多重作用机制的生物活性化合物。这种化学多样性使得病原体、杂草和昆虫更难产生抗性，进一步增强了其作为合成农药和抗生素的有效且可持续替代品的潜力。尽管过去几十年的部分研究关注了精油的抗菌、除草和驱虫作用，但蓝桉叶片年龄对这些生物效应的潜在影响尚未得到充分探索。随着蓝桉树的成熟，其叶片会发生显著形态变化，从幼树的宽大蓝灰色叶片变为成熟树的狭窄、厚实和深绿色叶片。这些形态结构差异反映了代谢活动的重大变化，进而可能影响精油的植物化学成分。已知植物材料的化学成分在生长过程中会因生理需求的变化而发生变化。因此，随着植株年龄的增长，代谢途径的活性往往会下降，从而限制植物化学物质的产生。已有研究表明，植物年龄是影响多种植物物种中精油成分和浓度以及生物活性的重要因素。类似地，先前的研究也表明，蓝桉叶片精油的化学成分会随树木成熟而变化，幼树和成熟树提取的精油之间存在显著差异。Pinto等人发现，来自幼树叶片的水提取物中含有更高水平的苯甲酸、碳水化合物、萜类衍生物、黄酮类、羟基肉桂酸以及鞣花酸、脂肪酸和没食子酸或其衍生物，而成熟树叶片提取物则富含单萜类和有机酸。Silvestre等人报告，来自幼树叶片的精油含有更高的α-蒎烯和β-蒎烯、β-蒈烯、柠檬烯和萜品烯浓度，而成熟树叶片提取物则含有更多的1,8-桉叶油醇和萜品烯-4-醇。然而，目前尚未研究这些化学成分差异是否转化为不同的生物活性。理解不同年龄树木叶片提取的精油之间的化学成分与生物活性之间的关系对于优化农业应用中的精油生产至关重要，因为其在害虫和疾病管理中的效果可能取决于特定生长阶段的化合物。因此，本研究的主要目的是表征并比较来自幼树或成熟树叶片提取的精油对农学相关害虫和疾病的生物活性，通过评估其对两种杂草（Portulaca oleracea L.和Solanum nigrum L.）、两种真菌病原体（Botrytis cinerea Pers.和Alternaria alternata (Fr.) Keissl Mn2.）、三种细菌病原体（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis、Xanthomonas euvesicatoria和Pseudomonas syringae pv. tomato）以及一种昆虫害虫（Phthorimaea absoluta (Meyrick, 1917)的除草、抗菌和杀虫效果。

**2 材料与方法**
2.1 **幼树叶片和成熟树叶片精油的提取**
2023年9月（夏季），从葡萄牙Porto森林区域的三个地点随机采集了幼树和成熟树的分枝（坐标：41.21865493821839, ?8.432903954132927）。仅采集了仅具有幼叶的幼树和仅具有成熟叶的成熟树样本。蓝桉树的分类基于叶部特征而非高度。幼叶特征为对生、宽大、蓝灰色的叶片，而成熟叶为互生、狭长、深绿色的叶片。虽然成熟树通常以成熟叶为特征，但在受到干扰后，萌芽枝或再生枝偶尔会产生幼叶型叶片，从而导致同一植株上同时存在幼叶和成熟叶。为了避免混淆，排除了同时具有两种叶片类型的树木。此后，从幼树和成熟树收集的叶片分别称为幼叶和成熟叶。收集生物量后，将叶片手工从茎上分离出来称重，并使用Clevenger装置通过水蒸馏法（HD）提取精油。为消除采集地点对精油化学成分的影响，每个地点的叶片分别处理，得到每种精油一份。因此，共获得了六种不同的精油：三种来自幼树叶片，三种来自成熟树叶片。蒸馏后记录精油的体积，以计算精油产量（% v/f.w.）。

2.2 **幼树叶片和成熟树叶片精油的化学表征**
两种精油的化学分析采用 gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) 进行成分鉴定，以及 gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID) 进行定量。GC–MS装置包括PerkinElmer Clarus 690气相色谱仪和PerkinElmer SQ 8T质谱仪（软件版本6.1，PerkinElmer，美国Shelton）。分离使用DB-1熔融硅胶柱（100%聚二甲基硅氧烷，内径30 mm，壁厚0.25 mm；J & W Scientific Inc., Rancho Cordova, CA, USA）。初始 oven 温度设定为45°C，然后以3°C/min的速率升至175°C，再以15°C/min的速率升至300°C，并在该温度下维持10分钟，总运行时间为61.67分钟。注射器和传输线保持在280°C，离子源设定为220°C。载气为氦气，流速为30 cm/s，分流比为1:40，电离能量为70 eV。扫描范围设定为40–300 m/z，扫描时间为1秒。通过比较保留指数（根据ISO标准计算）以及实验室图书馆中的标准品、实验室合成化合物和参考精油的GC–MS光谱来确认成分身份。GC-FID分析在Perkin-Elmer Clarus 400气相色谱仪（美国Shelton）上进行，配备两个火焰离子化检测器，数据处理器和split-splitless注射器端口，分别插入了两根不同极性的柱子：上述的DB-1熔融硅胶柱和DB-17HT熔融硅胶柱（(50%苯基)-甲基聚硅氧烷，内径30 mm，壁厚0.15 mm；J & W Scientific Inc.）。 Oven和注射器温度与GC–MS分析相同。检测器温度为300°C。载气为氢气（30 cm/s）。分流采样比例为1:50。注射体积为0.1 μL。根据ISO标准，通过两次注射的平均值计算精油百分比组成，无需使用响应因子。

由于化学表征显示采集地点不影响植物化学成分，因此将来自幼叶的三种精油合并为一个样本。对来自成熟树叶片的精油也采用相同程序进行处理。这些合并样本随后用于生物分析。

2.3 **幼树叶片和成熟树叶片精油的除草活性评估**
2.3.1 **测试物种和生长条件**
两种精油的除草活性在枯苗前和枯苗后条件下进行了评估，使用Portulaca oleracea L.（马齿苋）和Solanum nigrum L.（黑茄）作为模型杂草。种子从当地供应商处获取，使用70%（v/v）乙醇（10分钟）和20%（v/v）商用漂白剂（含5%有效氯；10分钟）表面消毒，然后用去离子水（dH2O）多次冲洗。实验在装有无菌纸盘的无菌培养皿中进行，并在其上施加处理液。所有实验均在控制条件下进行（温度：25°C；光照周期：16小时光照/8小时黑暗；光合有效辐射：120 μmol m?2 s?1）。

2.3.2 **实验设计**
在体外条件下评估了幼树叶片和成熟树叶片精油的枯苗前和枯苗后除草活性。为了评估其枯苗前除草活性，消毒后，将每种植物的10粒种子直接放在无菌纸盘上，并施加不同浓度（12.5、25、50、75和100% v/v）的精油1.5 mL。精油溶液位于纸盘中心，然后播种种子。未使用蒸汽处理；所有处理均以液体形式进行。每种精油的测试浓度是通过将精油原液稀释在dH2O中制备的。原液是通过将每种精油以2.4%（v/v）的比例溶解在0.5%（v/v）Tween-20?中制备的。作为对照（CTL），使用dH2O和0.5%（v/v）Tween-20?。对于枯苗后实验，将每种杂草的10粒种子播种在用dH2O湿润的无菌纸盘上。发芽7天后，将不同浓度（12.5、25、50、75和100% v/v）的精油1.5 mL以及0.5%（v/v）Tween-20?和dH2O施加在培养皿上。每种条件进行四个重复实验。孵育7天后，记录结果，并使用以下公式计算枯苗前试验的发芽百分比或枯苗后试验的死亡率。

2.4 **幼树叶片和成熟树叶片精油的抗菌活性评估**
2.4.1 **细菌物种和生长条件**
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst）、Xanthomonas euvesicatoria LMG905（Xeu）和Clavibacter michiganensis LMG7333（Cmm）在28°C下的Mueller-Hinton（MH）培养基（Liofilchem，Téramo，意大利）中培养，这是一种常用的非选择性抗菌培养基。为了评估幼树叶片和成熟树叶片精油的抗菌活性，准备了这三种细菌的同步培养物。为此，选择了每种植物病原体的单个菌落，并在液体MH培养基中培养。通过每个菌株在指数生长阶段的连续三次传代培养，生成了同步培养物，这些之前已经通过初步研究建立。培养物在28°C下，在220 rpm的振荡培养箱（Orbital Shaker，型号3500L，VWR?，Radnor，PA，美国）中孵育。然后将细菌悬浮液标准化至600 nm处的光密度为0.1（OD600）。

2.4.2 YEEO和AEEO的最低抑制浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）评估
根据Pinto等人12描述的方案，确定了每种植物病原体的YEEO和AEEO的最低抑制浓度（MIC）。简而言之，通过将相应的储备溶液稀释在dH2O中，制备了不同浓度的两种精油（0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50% v/v），如2.3.2节所述。作为对照，还使用了dH2O和0.5%（v/v）的Tween-20?。在无菌的96孔微孔板上，将10 μL的同步细菌悬浮液（来自各自病原体的三个独立培养物）与15 μL的10x MH培养基和155 μL的每种实验情况混合。抗生素链霉素被用作阳性对照。每种处理至少进行了3次重复实验。微孔板在Multiskan? GO（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）中在28°C下孵育48小时，每隔3小时测量一次OD600。在48小时的孵育结束时，使用系列稀释法确定了不同细菌物种的YEEO和AEEO的最低杀菌浓度（MBC）。简而言之，从各个孔中取100 μL的样品，用900 μL的dH2O稀释至六个系列稀释度。然后从每个稀释度中取10 μL滴加到营养琼脂（NA；Liofilchem，Téramo，意大利）上。在28°C下孵育48小时后，计算每种情况下的菌落形成单位（CFU）。

2.5 YEEO和AEEO的抗真菌活性评估
2.5.1 真菌菌株和生长条件
在体外条件下，评估了YEEO和AEEO对Botrytis cinerea Pers.（灰霉病）和Alternaria alternata (Fr.) Keissl Mn2的抗真菌活性，这些菌株来自Anna Maria Vettraino教授（意大利维泰博大学植物保护实验室）的真菌收藏。在使用前，这两种真菌菌株都是在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA；39 g L?1）中在室温下培养的。

2.5.2 实验设计
根据Vettraino、Zikeli、Scarascia Mugnozza、Vinciguerra、Tabet和Romagnoli24的方法，并稍作修改，评估了YEEO和AEEO的体外抗真菌特性。真菌菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；Difco，米兰，意大利）培养基上培养，培养基中添加了不同浓度（10, 20, 30, 40, 和50% v/v）的每种精油（EO），这些精油事先溶解在0.5%（v/v）的Tween-20?中。还准备了含有相同量无菌dH2O和0.5%（v/v）Tween-20?的对照平板。每个处理重复三次，实验重复两次。培养皿接种了从每种真菌菌落的活跃生长边缘取出的8 mm琼脂块（每个平板3个），并在25 ± 2°C下在黑暗中培养。10天后，测量了每种真菌分离株的辐射生长情况，并将结果记录下来。

2.6 YEEO和AEEO的杀幼虫活性评估
2.6.1 昆虫饲养
2025年春季，在Porto大学科学学院Vair?o农业校园的温室中播种Solanum lycopersicum L.植物，作为Phthorimaea absoluta Meyrick, 1917的寄主植物。发芽后4至6周，将植物移栽到盆中，并自然感染了首次出现的P. absoluta，这些P. absoluta来自校园内的Solanum nigrum L.植物。定期进行滴灌和修剪以刺激新枝条的生长。在2025年夏季（6月至7月），根据需要收集带有4至5龄幼虫的番茄叶子进行实验。

2.6.2 实验设计
使用从健康的两个月大植物上切下的番茄叶子评估YEEO和AEEO的杀幼虫活性，这些植物在受控条件下生长（温度：25°C；光周期：16小时光照/8小时黑暗；PAR：120 μmol m?2 s?1）。叶子通过叶柄以斜角切割并插入含有1.5%（v/v）琼脂的2 mL试管中。每个试管中放置一片叶子，然后放入Petri皿中。为了避免食物和空间的竞争，每片叶子只放置两只之前从昆虫饲养中收集的4至5龄P. absoluta幼虫。每种处理使用五个叶子的三个重复样本（每个重复样本10只幼虫）。测试了浓度为6.25%、12.5%、25%和50%（v/v）的精油，通过直接将10 μL精油滴在每个幼虫上来进行测试。YEEO或AEEO的储备溶液（100% v/v）是通过将每种精油溶解在2.4%（v/v）的大豆卵磷脂和20%（v/v）的丙酮中制备的。由于初步测试表明单独使用Tween-20?会导致P. absoluta幼虫高死亡率，因此改用了这种乳化系统。使用去离子水和大豆卵磷脂-丙酮混合物作为对照。培养皿在受控条件下维护（温度：23.4–28.0°C，平均25.5°C；相对湿度：61.7–76.6%，平均71.4%；光周期14:10（L:D）），并在处理后24小时和48小时记录幼虫死亡率。当幼虫在轻轻触碰时保持不动时，认为它们已经死亡。使用Abbott公式26校正死亡率数据：
校正后的值用于统计分析（如2.7节所述的双因素方差分析）。处理后48小时量化了挖掘活动。使用ImageJ软件确定了挖掘面积和总叶面积，并计算了挖掘活动的百分比。

2.7 统计分析
对于所有实验，每个实验条件至少包含三个独立重复样本（n ≥ 3），结果以平均值±标准偏差（SD）表示。使用Student's t检验比较了YEEO和AEEO的产率和化学成分。对于其他参数，进行了双因素方差分析（ANOVA），以“精油类型”和“使用的浓度”作为固定因素。当检测到显著效应（P < 0.05）时，应用Tukey的post hoc检验来识别因子水平之间的差异。在分析之前，分别使用Brown–Forsythe检验和Shapiro–Wilk检验测试数据的方差同质性和正态性。对于P. absoluta幼虫的死亡率，使用Abbott公式26校正后的值进行ANOVA。t检验和双因素ANOVA使用GraphPad Prism? 9.0（GraphPad Software，圣地亚哥，CA，美国）进行。使用IBM? SPSS Statistics 26.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）通过Probit分析估计半数致死浓度（LC??）和杀死90%种群的致死浓度（LC??）。

3 结果
3.1 YEEO和AEEO的产率和化学特性
从E. globulus叶子中提取的精油的产量随叶片年龄显著变化，年轻叶片中的精油产量为1.9%，而成年叶片中的产量为1.1%，产量高出42%（图1）。图1显示了从年轻（YEEO）和成年E. globulus树木（AEEO）叶子中提取的精油的产率百分比。*表示根据t检验，实验情况之间存在显著差异（P ≤ 0.05）。表1展示了YEEO和AEEO的化学成分。结果表明，尽管两种精油在质量上相似，但它们在数量上存在显著差异，个别化合物的相对浓度有所不同。例如，α-蒎烯和β-蒎烯在YEEO中的含量显著高于AEEO，而1,8-莰烯和反式-豆蔻烯在AEEO中的含量高于YEEO（表1）。关于组分分析，单萜烃在YEEO中的含量高于AEEO，而含氧单萜显示出相反的趋势。反过来，倍半萜烃和含氧倍半萜在两种精油中的含量都较低，在YEEO中略有增加，但未达到统计显著性。表1展示了从年轻（YEEO）和成年（AEEO）E. globulus树木叶子中提取的精油的平均百分比组成。

3.2 YEEO和AEEO的除草活性
3.2.1 出苗前
如图2所示，S. nigrum和P. oleracea对这两种精油的反应不同。对于P. oleracea，统计分析仅显示“浓度”因素有显著差异（图3(A)），表明记录的效果与精油类型无关。在这个物种中，当分别以25%和50%的浓度应用这两种精油时，种子发芽率分别下降了31%和89%，与对照组（dH2O；图3(A)）相比；而在最高浓度（75%和100%）时，发芽完全被抑制。对于S. nigrum，两个因素及其交互作用都显示出显著差异。将S. nigrum种子与YEEO在50%、75%和100%的浓度下培养后，发芽率分别下降了23%、49%和95%，与对照组（dH2O；图3(B)相比。相比之下，AEEO对种子发芽的影响更为严重，在50%的浓度下发芽率下降了76%，在最高两种浓度下完全抑制了发芽（图3(B)。

3.2.2 出苗后的除草潜力
图4和图5的结果表明，YEEO和AEEO对两种测试杂草物种具有相似的出苗后除草活性。实际上，对于所有测试的浓度，这两种精油都导致了P. oleracea幼苗的完全死亡（图4(A)和图5(A)）。反过来，对于S. nigrum来说，幼苗暴露于浓度高于12.5%的精油（EOs）会完全抑制其生长（见图4(B)和图5(B)）。图4显示了在受控条件下，7天大的P. oleracea（A）和S. nigrum（B）幼苗与不同浓度（12.5%、25%、50%、75%和100% v/v）的YEEO和AEEO共培养7天后的宏观效应。去离子水（dH2O）和0.5%（v/v）的Tween-20?（作为EOs的乳化剂）被用作对照组。图5显示了同样的实验条件下的幼苗死亡率。

3.3 YEEO和AEEO的抗菌活性

3.3.1 生长曲线
将Pst、Xeu和Cmm的同步培养物暴露于逐渐增加浓度的YEEO和AEEO 48小时后，结果显示这三种病原体对这两种EOs的敏感性不同，尽管它们都表现出剂量依赖性的抗菌效果（见图6）。此外，YEEO和AEEO对Pst和Xeu显示出不同的抗菌活性，而它们对Cmm的作用相似，这一点通过MIC值得到了证明。Cmm的MIC值为这两种EOs都是15%，而Pst和Xeu的MIC值对于两种EOs都是20%。然而，如图6所示，15%浓度的YEEO比同样浓度的AEEO更能抑制Pst的生长。相反，对于Xeu来说，15%浓度的AEEO表现出比15%浓度的YEEO更强的抗菌活性（见图6）。

3.3.2 细菌细胞存活率
将这三种细菌与逐渐增加浓度的YEEO和AEEO共培养48小时后，使用系列稀释法确定了每种植物病原体的最小抑制浓度（MBC）（见图7）。统计分析显示，浓度因素对Pst和Cmm有显著影响（P ≤ 0.05）。对于Xeu来说，EO的类型和浓度及其相互作用都显示出显著差异。尽管存在这些变化，YEEO和AEEO在所有细菌菌株中都表现出相当的杀菌活性，Pst和Xeu的MBC值为20%（见图7(A)和图7(B)），Cmm的MBC值为15%（见图7(C)。

3.4 YEEO和AEEO的抗真菌活性
宏观观察（见图8）和径向生长测量（见图9）显示，在所有测试的浓度下，B. cinerea和A. alternata菌株的生长均未受到任何处理的影响（见图8和图9）。图8和图9显示了在受控条件下，用不同浓度的YEEO和AEEO（0%、10%、20%、30%、40%和50% v/v）培养7天后的Botrytis cinerea（A）和Alternaria alternata（B）的宏观效应。去离子水（dH2O）和0.5%（v/v）的Tween-20?（作为EOs的乳化剂）被用作对照组。

3.5 YEEO和AEEO的杀虫活性
对幼虫挖掘活动的统计分析仅显示出与“浓度”因素相关的显著差异。如图10和图11所示，通过番茄叶片上的挖掘面积估算的挖掘活动随着YEEO和AEEO浓度的增加而减少。总体而言，两种EO的效果之间没有显著差异。在最低测试浓度（6.25%）下，幼虫挖掘活动明显减少，且抑制效果逐渐增强，直到在最高浓度下完全抑制。图10显示了用不同浓度的YEEO和AEEO（6.25%、12.5%、25%和50% v/v）处理番茄叶片48小时后的宏观外观。图11显示了在受控条件下，用不同浓度的YEEO和AEEO处理48小时后P. absoluta幼虫的挖掘活动百分比。图12显示了在受控条件下，用不同浓度的YEEO和AEEO处理24小时和48小时后P. absoluta幼虫的死亡率。图12表明，在24小时和48小时的采样时间点之间没有显著差异，且YEEO和AEEO的幼虫死亡模式相似。事实上，统计分析仅检测到“浓度”因素的显著差异。两种EO都表现出浓度依赖性的杀虫活性，当幼虫用50%的YEEO或AEEO处理48小时时达到总死亡率。总体而言，在这个培养时间后，12.5%的处理使幼虫死亡率增加了9倍。浓度增加到25%时，死亡率相对于12.5%翻了一番，而50%的浓度则使死亡率相对于12.5%增加了25倍。

4 讨论
为了减轻合成农药对环境和健康的负面影响，欧盟（EU）一直在逐步加强对合成农药的监管。在此背景下，《欧洲绿色协议》和《从农场到餐桌战略》设定了明确而雄心勃勃的目标，包括到2030年减少50%的农药使用量，要求开发和实施可持续的作物保护策略（https://food.ec.europa.eu/horizontal-topics/farm-fork-strategy_en）。在这种情况下，如EOs这样的环保植物源生物农药因其符合欧盟监管标准的能力而受到关注，同时也有助于促进综合害虫管理（IPM）和生物多样性保护。桉树EOs因其广谱生物特性而成为减少传统农用化学品应用的一种有前景的策略。然而，优化它们的农业应用需要更深入地了解叶片成熟度等因素如何影响其化学成分和生物活性。本研究通过评估从幼叶和成熟叶中提取的EOs的除草、抗菌、抗真菌和杀虫潜力，为它们对抗农学上重要的杂草、真菌病原体和昆虫害虫的有效性提供了宝贵的见解。

4.1 叶龄影响桉树叶EOs的化学组成
为了研究叶片成熟度对桉树EOs化学组成的影响，使用GC–MS分析了YEEO和AEEO。数据表明，尽管这两种EO在质量上相似，但α-蒎烯和β-蒎烯在YEEO中更为丰富，而1,8-桉叶油醇和反式蒎菖脑在AEEO中占主导地位。与本研究一致，Silvestre等人也报告称，在幼叶中EO的产量高于成熟叶。这可能归因于幼叶中分泌结构（如分泌腔）的更多和/或活性更强，这些结构有助于挥发性化合物的积累和释放。尽管两种EO表现出相似的挥发性特征，但在几种关键化合物的相对丰度上观察到了显著差异，这突显了发育阶段对其定量组成的影响。具体来说，YEEO中含有较高的α-蒎烯和β-蒎烯水平，这两种单萜烃以其强烈的抗菌和驱虫特性而闻名；而AEEO则富含1,8-桉叶油醇，这是一种公认具有抗菌和除草效果的文章中提到的氧化单萜。这些结果与Russo等人报告的结果一致，他们评估了从阿根廷收集的幼叶和成熟叶中提取的EOs的化学组成。类似地，之前关于Artemisia annua、Cymbopogon citratus和E. globulus的研究也得出结论，虽然EOs的整体化学组成在不同发育阶段大体一致，但个别化合物的相对丰度随叶片成熟度而变化。总之，这些发现表明随着叶片成熟，代谢方式从碳氢化合物向氧化化合物转变。相应地，成熟叶通常会产生更多的活性氧（ROS），这可能促进了碳氢化合物的氧化。此外，YEEO显示出更多的次要挥发性成分多样性，这表明随着叶片成熟，化合物多样性可能会减少。我们研究团队最近的一项代谢组学研究也证实了这一模式：68种代谢物受到叶片成熟度的显著影响，其中55种化合物在来自幼叶的提取物中的含量高于成熟叶的提取物。这些结果加强了年轻叶片可能产生更广泛特化代谢物的假设，可能反映了代谢途径的发育变化。

4.2 YEEO和AEEO的除草效果在双子叶杂草物种中的差异
尽管YEEO和AEEO之间存在化学差异，但两种EO都表现出相似的除草和抗菌活性。这表明整体生物活性可能是由组成化合物之间的复杂相互作用产生的，这些相互作用可能是协同的、加性的或对抗性的。在出苗后处理的情况下，YEEO和AEEO对两种杂草物种都显示出更高的效力。根据现有研究，已知像1,8-桉叶油这样的植物化学物质可以通过破坏细胞膜完整性、有丝分裂、呼吸作用和光合作用来干扰杂草的生长。正如先前其他研究（Benchaa, Hazzit等人，2018年）所报告的，这两种烯氧油的除草活性依赖于剂量，并且在不同的杂草物种之间表现出差异。实际上，欧芹（P. oleracea）和黑芥菜（S. nigrum）对烯氧油的敏感性不同，其中黑芥菜的耐受性更强。这一发现并不意外，因为已经有多种植物的烯氧油被报道具有物种特异性反应，包括桉树（38, 39）、迷迭香（Rosmarinus officinalis）、百里香（Thymus vulgaris）、高山薄荷（Satureja montana）、罗勒（Ocimum basilicum）和 Melissa officinalis（40, 41）。即使在比较单子叶植物和双子叶植物对桉树烯氧油的敏感性时，先前的研究也得到了不一致的结果，表明不能将敏感性推广到所有植物群体。例如，E. erythrocorys的烯氧油对双子叶植物野芥菜（Sinapis arvensis）和单子叶植物雀麦（Phalaris canariensis）显示出相似的效果（42）。相反，E. maculata对单子叶植物如硬质小麦（Triticum durum）和黑芥菜的除草效果更强（43）。而Ayd等人（44）则发现双子叶植物对E. cladocalyx的烯氧油更敏感。

4.3 YEEO和AEEO的抗菌活性突显了被测试细菌之间的差异性敏感性

尽管YEEO和AEEO的抗菌活性总体相似，但更详细的分析揭示了一些重要趋势。首先，与除草效果一样，这两种烯氧油的抗菌活性也依赖于剂量，越高浓度抑制细菌生长的效果越明显。这种剂量依赖性不仅在桉树烯氧油中得到证实（45），也在桉树的水提取物中得到证实（20），以及其他植物物种的烯氧油中得到证实，如柠檬香茅（Cymbopogon citratus）（46）、普通牛至（Origanum vulgare）（47）和迷迭香（Rosmarinus officinalis）（48）。

此外，革兰氏阳性细菌Cmm对这两种烯氧油的敏感性高于革兰氏阴性细菌Pst和Xeu，这可能是由于细菌细胞壁结构的不同影响了烯氧油的渗透性。革兰氏阳性细菌具有厚实但可渗透的肽聚糖层，允许疏水性和亲水性化合物的穿透，而革兰氏阴性细菌则受到脂多糖外层的保护，这可能限制了烯氧油的扩散。然而，关于这一点的文献意见并不一致。一些研究表明革兰氏阴性细菌对E. globulus烯氧油的敏感性更高（42），而其他研究则发现两组细菌的敏感性相当（45, 49, 50），或者发现其对革兰氏阳性菌株更有效（51），这表明细菌对烯氧油的反应也可能取决于物种特异性特征。尽管Pst和Xeu都是革兰氏阴性细菌，但在中间浓度下对烯氧油的反应却有所不同。例如，在15%（v/v）的浓度下，YEEO对Pst的抑制效果更强，而AEEO对Xeu的效果更强（43）。相反，Ayd等人（44）发现双子叶植物对E. cladocalyx烯氧油的敏感性高于单子叶植物。

4.4 YEEO和AEEO缺乏显著的抗真菌效果

在这项研究中，YEEO和AEEO没有表现出对抗灰葡萄孢（B. cinerea）或链格孢（A. alternata）的抗菌活性。这些发现与先前报道的类似烯氧油的抗真菌效果相矛盾，这可能是由于化学成分的不同或菌株之间的耐受性差异所致。有趣的是，这两种烯氧油都富含1,8-桉叶油、α-蒎烯和β-蒎烯等具有抗真菌特性的化合物，这些化合物此前已被证明能抑制多种真菌（5）。关于链格孢，Guleria, Tiku, Gupta, Singh, Koul和Razdan（54）发现富含α-蒎烯但缺乏1,8-桉叶油的E. tereticornis烯氧油仍然能够抑制该病原体。这种差异可能与YEEO和AEEO的化学成分有关，其中代谢物的相对丰度和化合物之间的潜在拮抗作用可能抵消了预期的抗真菌效果。Elaissi等人（55）的研究表明，在八种桉树中，1,8-桉叶油含量最低的E. odorata烯氧油表现出最强的抗真菌活性，完全抑制了红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、苏丹毛癣菌（T. soudanense）、犬小孢子菌（Microsporum canis）和白色念珠菌（Candida albicans）的生长，而富含1,8-桉叶油的烯氧油效果较差。总体上，这些发现强调了评估单个烯氧油成分及其组合的重要性，以更好地理解观察到的抗真菌效果缺乏背后的协同和拮抗机制。此外，与先前研究的差异也可能反映了真菌敏感性的菌株依赖性。事实上，D?n?和Valiu?kait?（56）发现不同菌株的灰葡萄孢对多种植物提取物的敏感性不同。因此，不仅要考虑烯氧油的组成和特定化合物的存在，还要考虑真菌反应的多样性，因为测试单一菌株可能无法得出具有代表性的结果。因此，需要进一步的研究，包括多种真菌菌株和更广泛的烯氧油化学类型，以得出更全面的结论。

4.5 YEEO和AEEO的杀幼虫效果表明，在低浓度下对第四至第五龄期的幼虫具有高致死率

正如它们的除草和抗菌活性一样，YEEO和AEEO也表现出对番茄叶矿虫（P. absoluta）第四至第五龄期幼虫的类似杀虫作用，显著减少了矿虫活动。此外，幼虫死亡率随着浓度的增加而增加，在最高浓度下达到总死亡。Probit分析证实了这两种烯氧油的强效性，24小时和48小时的LC50和LC90值相对较低，且重合范围表明它们的效果相似。虽然Russo等人（35）报告的从年轻和成熟桉树叶片中提取的烯氧油的化学类别与本研究中发现的相符，但他们观察到的杀虫效果针对的昆虫 pest不同。具体来说，年轻叶片提取的烯氧油在较低剂量下对 confuse 幼虫的杀虫效果更高。这些差异可能与目标昆虫种类、发育阶段和施用方法有关。在我们的研究中，这两种烯氧油是局部施用于P. absoluta幼虫的，而Russo（35）则是将含有测试溶液的滤纸浸泡在 Petri 盘中的 confuse 成虫中进行孵化的。相应地，Kobenan等人（57）评估了桉树烯氧油对棉铃虫（Pectinophora gossypiella）、拟步甲（Thaumatotibia leucotreta）和棉铃夜蛾（Helicoverpa armigera）的杀虫效果，发现其效果中等。拟步甲的敏感性最高（LC50 = 10.23%；LC90 = 37.57%），其次是棉铃虫（LC50 = 16.05%；LC90 = 43.40%）和棉铃夜蛾（LC50 = 16.32%；LC90 = 37.02%），其LC50和LC90值高于本研究的数值。同样，Bourakna等人（58）和Rekioua等人（8）发现桉树烯氧油对柑橘果蝇（Bactrocera oleae）和Ephestia kuehniella成虫也具有剂量依赖性的杀虫效果。此外，桉树烯氧油对Oxycarenus lavaterae成虫也表现出剂量依赖性的杀虫效果，在最高测试浓度下达到总死亡。这些发现突显了桉树烯氧油的强大杀虫潜力，这可能与其主要成分的生物活性有关。像1,8-桉叶油、α-蒎烯和α-萜品醇这样的化合物已知可以通过抑制乙酰胆碱酯酶活性干扰昆虫的神经系统，最终导致神经肌肉功能障碍（59）。此外，这些化合物还具有较高的溶解度，不仅可以干扰膜结构，还可以使细胞内酶失活并破坏离子平衡（53）。这些化合物的效果还受到外膜通透性的影响，而外膜通透性因细菌种类而异，从而影响它们对烯氧油成分的整体敏感性（52）。为了更好地阐明这两种革兰氏阴性细菌对YEEO和AEEO差异性敏感性的机制，未来的研究应调查单个烯氧油成分单独及联合使用对特定细菌细胞和分子靶点的影响。特别需要注意它们对外膜和细胞质膜、外排泵活性、脂多糖结构以及防御相关基因表达的影响，这可能为烯氧油与细菌相互作用的分子基础提供宝贵见解。

4.5 YEEO和AEEO缺乏显著的抗真菌效果

在这项研究中，YEEO和AEEO对灰葡萄孢（B. cinerea）或链格孢（A. alternata）没有表现出抗真菌活性。这些发现与先前报道的类似烯氧油的抗真菌效果相矛盾，这可能是由于化学成分的不同或菌株之间的耐受性差异所致。有趣的是，这两种烯氧油都富含1,8-桉叶油、α-蒎烯和β-蒎烯，这些化合物已被广泛报道具有抗真菌特性，并且之前已被证明能抑制多种真菌（5）。关于链格孢，Guleria, Tiku, Gupta, Singh, Koul和Razdan（54）发现富含α-蒎烯但缺乏1,8-桉叶油的E. tereticornis烯油仍能抑制该病原体。这种差异可能与YEEO和AEEO的特定化学成分有关，其中代谢物的相对丰度和化合物之间的潜在拮抗作用可能抵消了预期的抗真菌效果。Elaissi等人（55）发现，在八种桉树中，1,8-桉叶油含量最低的E. odorata烯氧油表现出最强的抗真菌活性，完全抑制了红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、犬小孢子菌和白色念珠菌的生长。在本研究中，富含1,8-桉叶油的烯氧油效果较差。总体而言，这些发现强调了评估单个烯氧油成分及其组合的重要性，以便更好地理解观察到的抗真菌效果缺乏背后的机制。此外，与先前研究的差异也可能反映了真菌敏感性的菌株依赖性。事实上，D?n?和Valiu?kait?（56）发现不同菌株的灰葡萄孢对多种植物提取物的敏感性不同。因此，不仅要考虑烯氧油的组成和特定化合物的存在，还要考虑真菌反应的多样性，因为测试单一菌株可能无法得出具有代表性的结果。因此，需要进一步的研究，包括多种真菌菌株和更广泛的烯氧油化学类型，以得出更全面的结论。

5 结论

本研究证明，来自年轻和成熟桉树叶片的烯氧油表现出相似的除草、抗菌和杀虫活性，尽管它们的化学成分存在定量差异，其中YEEO富含单萜烃（α-蒎烯和β-蒎烯），而AEEO富含氧化化合物（1,8-桉叶油）。这两种烯氧油都对欧芹（P. oleracea）和黑芥菜（S. nigrum）表现出强烈的萌发后除草效果，对致病细菌具有剂量依赖性的抗菌活性，其中Cmm的敏感性最高，并且在低致死浓度下对P. absoluta幼虫具有强大的杀虫活性。这两种烯氧油均没有表现出对抗灰葡萄孢或链格孢的抗菌活性，表明其在广谱抗菌效果方面存在局限性。鉴于年轻和成熟叶片提取的烯氧油的生物活性相似，大规模生产在经济上和环境上都是可行的，特别是利用成熟叶片，这是造纸和家具工业的丰富副产品，以及清除土地作业的副产品。这种废弃生物质的利用为烯氧油的生产和农业应用提供了一条可持续的途径。然而，由于这些试验是在受控实验室条件下进行的，因此需要进行全面的田间试验，以评估桉树烯氧油在真实农业环境中的效果。此外，仍存在一些局限性，包括缺乏抗真菌活性和与烯氧油稳定性、疏水性和挥发性相关的潜在挑战。因此，未来的研究应重点开发创新的递送系统，如纳米粒子以实现烯氧油的整合，并评估环境安全性，以确保桉树烯氧油在可持续害虫管理策略中的有效和负责任的应用。

致谢

本工作得到了葡萄牙科技基金会（FCT）通过2021.BD.07342博士奖学金、研究项目PCIF/GVB/0150/2018以及“Ver?o com Ciência 2020- Hands on Science for Sustainable AgriFood Production: From the Soil to the Fork”项目的支持。FCT/MCTES还在战略项目UID/05748/2025和UID/PRR/05748/2025（DOI分别为https://doi.org/10.54499/UID/05748/2025和https://doi.org/10.54499/UID/PRR/05748/2025）以及UID/00329/2025 CE3C & CHANGE的范围内提供了资金支持。此外，CA21134 COST行动（T0P-AGRI-Network）也提供了财务支持。开放获取出版物的资金由FCT（b-on）提供。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。