铜(II)在刺突蛋白片段配位中优于其他金属离子，驱动活性氧依赖的氧化反应

《Inorganic Chemistry Frontiers》：Copper(II) outcompetes other metal ions in spike fragment complexation, driving ROS-dependent oxidation

　　

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白在病毒入侵肺细胞中发挥核心作用，并被证实可促进2019冠状病毒病(COVID-19)患者体内活性氧(ROS)的生成。尽管已有大量研究，刺突蛋白相关氧化还原活性的分子机制仍未得到充分阐明，尤其是金属离子的影响。研究人员针对生物必需金属离子(铜离子Cu2+、亚铁离子Fe2+、铁离子Fe3+、锰离子Mn2+、钴离子Co2+、锌离子Zn2+)及潜在必需金属离子镍离子Ni2+，探究其与修饰后刺突蛋白片段(Ac-ADGKAHFPRE-NH2，S4；Ac-HDGKAAFPRE-NH2，S5)的配位特性。电位滴定与光谱分析显示，在模拟肺部生理pH 6.7条件下，Cu2+可形成最稳定的配合物，其中S4以3N{Nim，2N?}为主要配位模式，S5则以1N{Nim}为主。电化学与电子顺磁共振(EPR)研究表明，铜肽配合物可发生氧化还原循环，还原为亚铜离子Cu+。该氧化还原活性驱动ROS生成，抗坏血酸消耗实验、罗丹明6G(R6G)降解实验及凝胶电泳验证其可产生羟基自由基(•OH)、单线态氧(1O2)及超氧阴离子(O2•?)。生成的ROS可诱导DNA双链断裂，其中Cu(II)-Ac-ADGKAHFPRE-NH2配合物(CuS4)的氧化潜能高于Cu(II)-Ac-HDGKAAFPRE-NH2配合物(CuS5)。在Cu(II)/过氧化氢(H2O2)体系中，配合物产生的ROS可直接氧化特定氨基酸残基：存在抗坏血酸时，氧化主要发生在组氨酸残基；无抗坏血酸时，赖氨酸残基发生选择性氧化生成α-氨基己二酸，表明存在氧化还原依赖的残基特异性氧化途径。

研究背景与意义

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引发的2019冠状病毒病(COVID-19)重症患者中，氧化应激水平显著升高，活性氧(ROS)过量产生与肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及多器官病理改变密切相关。刺突蛋白作为病毒入侵宿主细胞的关键因子，已被证实可独立诱导ROS生成，但既往研究未考虑生理环境中过渡金属离子的调控作用。人体内铜、铁、锰等必需金属离子稳态在COVID-19病程中发生显著改变，其中肺部炎症部位铜离子浓度升高尤为明显。过渡金属可通过芬顿反应(Fenton reaction)催化ROS生成，但其与刺突蛋白的相互作用机制尚未明确。本研究聚焦于刺突蛋白片段的金属配位特性，旨在揭示铜离子如何通过配位作用增强刺突蛋白的氧化还原活性，阐明其驱动ROS生成及引发生物分子损伤的微观机制，为理解COVID-19病理进程中的金属离子调控效应提供分子层面证据。相关成果发表于《Inorganic Chemistry Frontiers》。

关键技术方法

研究人员设计合成两个基于SARS-CoV-2刺突蛋白序列的修饰多肽片段S4与S5，通过电位滴定法测定金属离子配位稳定常数，结合紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、圆二色谱(CD)、电子顺磁共振(EPR)及电喷雾质谱(ESI-MS)解析配合物空间构型。采用循环伏安法表征配合物氧化还原性质，通过抗坏血酸消耗实验、罗丹明6G(R6G)降解实验定量评估ROS生成能力，利用质粒DNA凝胶电泳验证DNA损伤程度，结合液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)鉴定多肽氧化产物及位点特异性。所有实验均在模拟肺部生理pH 6.7条件下开展，以排除酸碱环境干扰。

研究结果

过渡金属离子与刺突蛋白片段的相互作用

电位滴定结果显示，在测试的7种金属离子中，仅Cu²⁺与Ni²⁺可与S4、S5形成稳定配合物，其中Cu²⁺配合物稳定性显著高于Ni²⁺。在pH 6.7条件下，S4主要以CuH_?1L物种存在(占比约80%)，配位模式为3N{N_im，2N^?}，即1个组氨酸咪唑氮与2个酰胺氮参与配位；S5则同时存在CuHL(50%)与CuL(20%)两种物种，分别以1N{N_im}和2N{N_im，N^?}模式配位。光谱特征与质谱数据进一步验证了上述配位结构，表明刺突蛋白片段的组氨酸残基是Cu²⁺配位的核心位点。

氧化还原性质

循环伏安实验显示，CuS4与CuS5配合物均表现出准可逆的表面受限氧化还原过程，阳极峰对应组氨酸残基氧化，阴极峰反映氧化产物的结构重组。抗坏血酸还原实验表明，CuS5中Cu²⁺的还原速率显著快于CuS4，1小时内即可完全还原为Cu⁺，而CuS4还原率为70%，提示CuS5具有更强的氧化还原循环潜力。

ROS生成监测

抗坏血酸消耗实验中，CuS4+H₂O₂体系对抗坏血酸的氧化速率高于游离Cu²⁺离子，表明其具有更强的ROS生成能力。罗丹明6G降解实验证实，两种配合物在H₂O₂或抗坏血酸存在下均可高效产生羟基自由基(•OH)，且生成速率相当，二甲基亚砜(DMSO)可完全淬灭该过程，验证了•OH的特异性生成。

凝胶电泳分析

质粒DNA损伤实验显示，CuS4与CuS5在无外加还原剂时即可诱导DNA双链断裂，加入H₂O₂后，约70%的DNA转化为线性形式，损伤程度显著高于此前报道的其他刺突蛋白片段配合物。ROS清除剂实验证实，两种配合物可同时生成•OH、单线态氧(¹O₂)及超氧阴离子(O₂•^?)。抗坏血酸存在时，CuS4诱导的DNA线性化程度(65%)高于CuS5，提示其总ROS生成量更高。

多肽氧化

LC-MS/MS分析表明，多肽氧化路径具有氧化还原依赖性：存在抗坏血酸时，氧化发生于组氨酸残基，生成单氧化产物；无抗坏血酸时，氧化特异性靶向赖氨酸残基，经两步氧化脱氨生成α-氨基己二酸——该代谢物已被报道为COVID-19患者的潜在血清生物标志物。

讨论与结论

本研究首次证实SARS-CoV-2刺突蛋白片段可通过组氨酸介导高效结合Cu²⁺，形成具有氧化还原活性的配合物。该配合物可在生理条件下驱动Cu²⁺/Cu⁺循环，通过类芬顿反应生成多种ROS，其DNA损伤能力强于已报道的其他刺突蛋白金属配合物。研究揭示了氧化还原环境对多肽氧化位点的调控作用：抗坏血酸存在时靶向组氨酸，缺乏时靶向赖氨酸并生成α-氨基己二酸。这一发现不仅阐明了金属离子在刺突蛋白致病机制中的关键作用，也为理解COVID-19中氧化应激与金属稳态紊乱的关联提供了分子证据。α-氨基己二酸的生成可能进一步加剧促氧化环境，形成病理正反馈环路，为开发靶向金属-刺突蛋白相互作用的干预策略提供了理论依据。