叶绿体定位蛋白AT4G33780的表型特征研究表明，该蛋白的改变会影响拟南芥的生长以及对镍胁迫的反应

《Plant Gene》：Phenotypic characterization of the chloroplast-localized protein AT4G33780 reveals altered growth and nickel stress responses in Arabidopsis

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建拟南芥AT4G33780基因的敲除和过表达株系，发现该基因在种子萌发、幼苗建立及营养生长中起关键作用，并能响应镍胁迫。转录组学和代谢组学分析表明其通过调控细胞壁相关基因和中心碳代谢途径起作用，揭示AT4G33780作为叶绿体关联的代谢调节因子，影响植物发育和胁迫响应的分子机制。

　　

杨正超

杭州师范大学生命与环境科学学院，中国杭州311121

摘要

叶绿体不仅参与初级代谢，还通过代谢信号传导调节植物的生长和应激适应。AT4G33780被注释为一种潜在的ATP磷酸核糖转移酶（ATP-PRT）调节亚基，并预测其定位于叶绿体中。然而，其在植物中的生理功能仍不清楚。在这里，我们使用CRISPR/Cas9敲除和过表达系在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中研究了AT4G33780的功能。AT4G33780定位于叶绿体中，并表现出组织特异性表达。AT4G33780的基因扰动导致了剂量依赖性的表型变化，这些变化影响了种子萌发、早期幼苗建立、营养生长以及根系对镍胁迫的反应。转录组分析显示了广泛的转录重编程，包括与细胞壁相关的基因家族的协调变化，而非靶向代谢组学则发现了中心碳代谢的广泛改变。综合分析表明，AT4G33780作为一种叶绿体相关调节因子，在不同条件下将代谢状态与发育结果联系起来。这些发现将AT4G33780确定为发育和应激相关反应的调节因子，并为未来的机制研究提供了基础。

引言

叶绿体在植物细胞中通过维持光合作用和初级代谢发挥着重要作用，同时也通过代谢和逆向信号通路参与生长、发育和环境响应的调节（Woodson和Chory，2008；Chan等人，2016）。尽管已经鉴定出许多定位于叶绿体的蛋白质，但仍有相当一部分蛋白质的功能尚未明确，这限制了我们对叶绿体相关因子如何参与发育调节和应激适应的理解。

AT4G33780在拟南芥信息资源（TAIR）数据库中被注释为一种潜在的ATP磷酸核糖转移酶（ATP-PRT）调节亚基，并预测其定位于叶绿体中。在植物中，ATP-PRT催化组氨酸生物合成的第一个关键步骤（Ruszkowski，2018）。在拟南芥中，已经鉴定出两种同源的ATP-PRT蛋白，ATP-PRT1（AT1G58080）和ATP-PRT2（AT1G09795）（Ohta等人，2000）。然而，AT4G33780在植物中的具体生理功能仍不清楚。目前尚不清楚AT4G33780是参与组氨酸相关的代谢，还是发挥与叶绿体功能相关的更广泛的调节作用。

植物的生长和形态发生需要细胞代谢和结构成分的协调调节。特别是，细胞壁的动态修饰与细胞扩张、组织分化和器官形成密切相关（Cosgrove，2005；Houston等人，2016）。典型的与细胞壁相关的蛋白质家族包括扩展蛋白（EXP）（Taiz，1994）、木葡聚糖内转糖基酶/水解酶（XTH）（Ekl?f和Brumer，2010）以及 invertase/果胶甲酯酶抑制剂（INV/PMEI）超家族（Coculo和Lionetti，2022），这些蛋白质在生长和环境响应过程中参与细胞壁的重塑。与细胞壁相关的基因表达通常会对发育和环境信号作出响应，表明结构重塑与代谢状态紧密相关（Wolf等人，2012）。然而，连接细胞器功能、代谢状态和发育结果的上下游调控成分尚未完全明确。

镍（Ni）作为一种必需的微量营养素，在低浓度下对植物没有影响，但在高浓度下会强烈影响根系生长和整体植物发育（Seregin和Kozhevnikova，2006；Hassan等人，2019）。植物对镍的响应涉及代谢、生长动态和细胞结构的协调调整。尽管对金属稳态和耐受机制的认识不断深入，但叶绿体相关调节因子对这些过程的贡献仍不清楚。组氨酸被认为参与了植物中的镍螯合和金属耐受，将氨基酸代谢与重金属响应联系起来（Kr?mer等人，1996；Ingle等人，2005）。鉴于AT4G33780被注释为一种与ATP-PRT相关的蛋白质，因此使用镍处理作为生理相关条件来评估AT4G33780的扰动是否会影响应激相关的发育表型。

在这项研究中，我们旨在功能上表征拟南芥中的AT4G33780。我们生成了CRISPR/Cas9敲除突变体和过表达（OE）系，以检查基因扰动的发育后果。通过亚细胞定位和表达分析来定义其空间分布。我们系统地评估了种子萌发、早期幼苗建立、营养生长以及根系对镍胁迫的反应。为了探讨与AT4G33780表达改变相关的分子变化，我们进行了转录组测序和非靶向代谢组学分析。我们的结果揭示了与AT4G33780扰动相关的剂量和情境依赖性表型，并发现了协调的转录和代谢变化。这些发现表明AT4G33780是一种影响植物发育和应激相关反应的叶绿体相关调节因子。

部分摘录

植物材料和生长条件

本研究使用拟南芥Columbia-0（Col-0）生态型作为野生型（WT）背景。所有转基因系都是在Col-0背景下生成的。

种子经过表面灭菌后，在4°C下黑暗条件下培养2-3天以促进萌发。幼苗在半浓度的Murashige和Skoog（1/2 MS）培养基上生长，培养基中添加了1%（w/v）的蔗糖，并用0.8%（w/v）的琼脂固化，在受控的生长条件下进行培养（Murashige和Skoog，1962）。

AT4G33780的亚细胞定位和生物信息学分析

使用iPSORT网络服务器进行的信号肽预测表明，N端的30个氨基酸（MPFSASISSPSSSVALLRSPLSFFIFTPKT）可能作为叶绿体转运肽，提示AT4G33780定位于叶绿体（图S1）。此外，使用基于隐马尔可夫模型的TMHMM 2.0工具进行了跨膜结构域的预测（图S1）。结果显示AT4G33780含有三个潜在的跨膜结构域。

AT4G33780对发育稳健性的剂量依赖性调节

在生成过表达系的过程中，AT4G3370的全长编码区（CDS）与GFP在预测的转运肽下游的C末端融合，从而保持了蛋白质的整体结构完整性。虽然不能完全排除GFP标签可能对蛋白质功能产生轻微影响，但未观察到由于融合本身导致的明显异常生长或发育表型。GFP标记在植物功能研究中已被广泛应用。

结论

在这项研究中，我们确定AT4G33780是一种定位于叶绿体的因子，它调节拟南芥的发育和应激相关的生长反应。通过综合遗传学、表型学、转录组学和代谢组学分析，我们发现AT4G33780的功能是剂量和情境依赖性的，而不仅仅是一种简单的生长促进或抑制因子。

AT4G33780表达的扰动导致了特定阶段和非线性的表型变化，影响了种子...

CRediT作者贡献声明

杨正超：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，资源准备，项目管理，方法学，实验设计。

资金支持

作者们没有获得这项研究的任何财务支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢中国国家水稻研究所在Hi-TOM高通量测序方面的技术支持，以及提供共聚焦显微镜设施的便利。我们还要感谢Yu Zhiming博士在手稿准备过程中提供的有益讨论和建设性建议。