小球藻固定化与电容测量的趋势分析 卡洛斯·奥坎波-洛佩斯（Carlos Ocampo-López）、 莱迪·伦东-卡斯特里隆（Leidy Rendón-Castrillón）、 玛格丽塔·拉米雷斯-卡莫纳（Margarita Ramírez-Carmona）、 费德里科·冈萨雷斯-洛佩斯（Federico González-López）、 西蒙·雷斯特雷波-尼托（Simón Restrepo-Nieto） 以及 阿尔瓦罗·奥斯皮纳-桑胡安（álvaro Ospina-Sanjuan）

《Processes》：Trend Analysis of Chlorella sp. Immobilization Versus Capacitance Measurements Carlos Ocampo-López, Leidy Rendón-Castrillón, Margarita Ramírez-Carmona, Federico González-López, Simón Restrepo-Nieto and álvaro Ospina-Sanjuan

　　摘要：本研究探讨了将小球藻（Chlorella sp.）固定在尼龙基质中的方法，以分析其保留行为并监测生物量的附着情况。结合了图像捕捉和处理技术以及随时间变化的电容测量，使用基于Python的数据分析代码进行实验。实验在2升的光生物反应器中进行，控制条件为24°C、连续通气量9.31 L/min以及光照强度71 μmol m?2 s?1。该方法能够量化基质表面的生物量分布，以及微藻培养物的电容和光密度的变化。结果显示，最大生长发生在第15天左右，光密度（686纳米处的吸光度）、基质图像分析和电容记录之间存在强相关性。此时，吸光度达到3.913，尼龙基质上的覆盖率为24.56%，电容为375.9 μF。电容测量被证明是一种有用的间接工具，用于估计生物量的附着情况，而图像分析则提供了空间分布信息。过程中变量呈现的上升趋势突显了如电容这样的电参数在监测悬浮系统中微藻固定化方面的潜力，而不会改变生物膜结构。这种方法为未来在生物活性化合物生产或环境处理系统的扩建应用提供了支持。

1. 引言
2024年全球微藻市场规模估计为128.1亿美元，并预计从2025年的138.5亿美元增长到2034年的约275.4亿美元，2025年至2034年间的复合年增长率为7.95%[1]。2024年北美占据微藻市场的37.2%[2]。微藻对人类和生态系统有益，因为它们在光合作用过程中吸收二氧化碳并释放氧气。此外，微藻在多种生物技术应用中引起了特别关注。生物燃料生产是其中最受欢迎的应用之一。例如，Ananthi等人[3]提出了基于微藻的生物柴油作为第三代生物燃料的可行方案，而Ganesan等人[4]全面回顾了其潜力和挑战。Khoo等人[5]强调了通过遗传修饰来提高脂质产量的策略，Peng等人[6]则强调了微藻生物燃料的环境效益。最近，Sathya等人[7]讨论了大规模采用所需克服的研究空白和技术障碍。

生物修复是另一个广泛研究的应用领域。Devi等人[8]展示了微藻在去除制革废水中的污染物同时产生增值化合物的双重作用。Kashem等人[9]分析了微藻在处理咸水养殖废水中的作用。Tambat等人[10]报告了成功去除钼污染物的案例，Khan等人[11]则提供了使用微藻系统处理 Pharmaceutical 废水的更广泛视角。多位作者强调了微藻生成增值化合物的能力。除了在废水处理中的应用[8]外，Maghzian等人[12]探索了高效获取商业产品的途径。Pradhan等人[13]回顾了提高回收率的预处理策略，而Sun等人[14]专注于将二氧化碳转化为高价值生物产品的研究。Ezhumalai等人[15]讨论了微藻在循环经济中的作用，Li等人[16]强调了从废水中回收营养物质的重要性，Katiyar和Arora[17]发现了具有健康促进特性的微藻脂质。

在哥伦比亚，关于微藻使用的主要报告集中在加勒比海岸地区，尤其是在水产养殖生产系统中的饲料应用[18,19]。在工业领域，微藻被研究用于生物柴油生产[20]，而在食品领域，它们被用作膳食补充剂以预防疾病和改善健康[21]。全球市场涉及多种微藻物种，包括螺旋藻（Spirulina）、小球藻（Chlorella）、浅绿色小球藻（Nannochloropsis）、血红球藻（Haematococcus）、 isoChrysis 和小球藻（Chlamydomonas）等[15]。这些物种被用于食品和饲料应用。Ezhumalai等人[15]强调了它们在可持续生物质利用中的作用，而Castro等人[22]比较了螺旋藻和小球藻菌株在营养方面的生产潜力。近年来，由于对这些物种衍生的蛋白质和维生素等营养素的研究和开发不断增加，全球市场经历了显著增长[1]。

使用微藻大规模生产生物基化合物的技术发展需要能够在加工过程中维持高细胞浓度的系统。为此，采用了固定化系统，这些系统通过固定化基质来提高生物量浓度，同时保护细胞。这些系统减少了底物和产品的抑制作用，延长了生长周期，提高了代谢活性，增加了生产力，并简化了分离过程，从而获得了澄清的最终产品。固定化技术还解决了稳定性、细胞活力、通过重复使用和回收实现经济效益、减少操作时间、降低生产成本以及批次处理的可行性等问题[23]。

在文献中，已报道了将Nannochloropsis sp.封装在藻酸盐凝胶中的固定化方法，类似地，Scenedesmus sp. 细胞也被固定在藻酸盐凝胶球中[24]。其他技术包括化学结合，涉及共价键或交联剂（如戊二醛）和光交联树脂；然而，这种方法可能会损伤细胞表面并大大降低活体微藻的活力[25]。离子吸引也被用作固定化方法，因为它对细胞活力的影响较小，尽管其有效性取决于介质的pH值和离子强度。另一种替代方法是使用絮凝剂进行固定化，其中牛奶酪蛋白絮凝物既作为固定化材料又作为生物吸附剂，能够捕获培养物中高达67%的微生物[25]。还采用了在聚合物基质上的吸附过程，使用低成本试剂（如羧甲基纤维素）来实现生物量的限制[23]。后一种技术结合了聚合物凝胶固定化和在尼龙网上的吸附。

固定化是一种通过物理或化学手段将生物量（微生物或酶）限制在定义的空间域内的技术，防止自由移动，同时保持活性并便于分离和回收[26]。这一过程受到细胞通过氢键、范德华力和疏水相互作用等弱键对支撑物的可逆粘附的影响[23]。尽管文献中提出了多种技术，但由于培养条件的变化、快速的生长速率以及物种间的差异，在量化微生物及其在表面上的附着情况方面仍存在局限性。

本研究评估了小球藻（Chlorella sp.）的固定化过程，以确定其固定化速率与电容测量之间的关系。通过开发一种代码来识别具有较高细胞密度的区域以及尼龙聚合物基质上的表面变化，建立了生长参数与固定化表面积定量分析之间的关联。这种方法为监测淹没系统中的微藻物种固定化提供了另一种途径，具有在代谢物生产、废水处理和废水回收等领域的潜在工业应用潜力。

2. 材料与方法
2.1. 小球藻（Chlorella sp.）
用于固定化过程的微藻菌株是从波利瓦尔庞蒂菲卡大学（Medellín, Colombia）生物技术研究中心（CIBIOT）的菌株库中获得的。该过程在无菌的1.5升反应器中进行，添加了0.5克/升的N.P.K.叶面肥料液体（16:16:12）（Vanofis, Colombia）作为培养基。配制基液的初始电导率为0.94 mS/cm，初始pH值为6.8 ± 0.2，处于小球藻培养的最佳范围内。培养物在连续通气量9.31 L/min、24°C的温度和连续光照条件下维持了15天。

2.2. 小球藻（Chlorella sp.）的生长动力学
在控制实验中，小球藻（Chlorella sp.）的生长动力学在2升生物反应器中进行了监测，有效工作体积为1.6升，操作条件与2.1节所述相同。每24小时取10毫升样本，进行匀质处理，并使用UV-Vis光谱仪（Shimadzu, UV-160IPC, Kyoto, Japan）在400–700 nm范围内进行光谱扫描，以识别浊度变化。通过光谱扫描确定的特征波长处的光密度来跟踪生长动力学。

2.3. 小球藻（Chlorella sp.）的固定化
小球藻（Chlorella sp.）被固定在浸没在2升光生物反应器（操作体积1.6升）中的尼龙聚合物基质上，遵循[23]描述的方法。添加了1%（w/v）的羧甲基纤维素（纯度99.5%，Mundo Huevo, Medellín, Colombia）作为聚合物试剂，系统运行了15天。固定化监测通过数字万用表（UNI-T, UT89X, Dongguan, China）每12小时进行一次电容测量，并在受控光照、强度和中性背景条件下每24小时进行一次拍照监测。图像使用固定焦距为12万像素的相机（Galaxy S24, Samsung, Seoul, Republic of Korea）拍摄，配备广角系统和1.5倍放大倍率。每张图像随后在分析环境中使用cv2.imread()函数进行处理。为了提高阈值质量和减少数字噪声的影响，图像被转换为灰度（cv2.cvtColor）并用高斯模糊滤波器（cv2.GaussianBlur, kernel 5 × 5）进行平滑处理，生成灰度强度矩阵。

所有关于微藻生长和固定化的实验均重复进行了三次，误差条表示实验数据的标准差（平均值 ± 峰值）。

2.4. 生长过程与固定化过程之间的动态相似性分析
为了比较生物过程监测三个变量之间的动态相似性和行为模式——A（未固定化培养物的686纳米处吸光度）、I（固定化培养物的电容，μF）和C（未固定化培养物的电容，μF）——开发了一种分析程序，以评估这些数据系列之间的时间和动态相似性，考虑到整个15天的实验期间。每个变量都被标准化到0到1的范围内以便于比较。

2.4.1. 二阶导数的计算
为了捕捉变化的动态和加速过程，计算了每个变量相对于时间的二阶数值导数。由于采样间隔不均匀，采用了基于二阶插值的非均匀网格的有限差分方案。点的二阶导数是前向和后向差异的加权平均值，如方程（1）所示。

2.4.2. 使用动态时间规整（DTW）的相似性分析
为了评估曲线之间的动态相似性，应用了动态时间规整（DTW）算法，该算法允许比较可能发生位移或变化速率不同的时间序列[27]。fastdtw实现用于以计算效率逼近最小规整距离，采用欧几里得距离度量。DTW距离是在每对二阶导数之间计算的：DTW(d2A/dt2, d2I/dt2), DTW(d2A/dt2, d2C/dt2), DTW(d2I/dt2, d2C/dt2)。每个结果表示两条曲线之间的时间对齐成本。

分析在Python 3.11（Python Software Foundation, Wilmington, DE, USA）中进行，使用了Code 1中描述的算法，并使用了pandas（v2.2.2）、NumPy（v2.0.2）、fastdtw（v0.3.4）和matplotlib（v3.10.0）库。时间序列是从结构化的Microsoft Excel 2021文件（.xlsx）（Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA）中分析的，该文件包含一列采样日和每列变量（A, I, 和 C）。

Code 1. 用于DTW计算的Python 3.11算法
```python
import pandas as pd
from fastdtw import fastdtw
import numpy as np

def custom_euclidean_distance(x, y):
return np.sqrt(np.sum((x ? y)**2)

file_name = “data.xlsx”
df = pd.read_excel(file_name)
required = {'A', ‘I’, ‘C’}
missing = required ? set(df.columns)
if missing:
raise ValueError(f”Excel文件中缺少所需列：{sorted(missing)}”

column_A = df[‘A’].to_numpy()
column_I = df[‘I’].to_numpy()
column_C = df[‘C’].to_numpy()

distance.AI, path.AI = fastdtw(column_A, column_I, dist=custom_euclidean_distance)
distance_AC, path_AC = fastdtw(column_A, column_C, dist=custom_euclidean_distance)
distance_IC, path_IC = fastdtw(column_I, column_C, dist=custom_euclidean_distance)

print(f”A和I之间的DTW距离：{distance_AI}”)
print(f”A和C之间的DTW距离：{distance_AC}”
print(f”I和C之间的DTW距离：{distance_IC}”
```**基于数字图像处理的细胞固定光学分析**

为了量化细胞在圆形支撑表面上的固定区域，我们使用了Python 3.11及OpenCV、NumPy和Matplotlib库实现了计算光学分析程序。

**2.5.1 检测暗区（固定生物量）**

定义了一个阈值标准来识别与黏附在表面的生物量相关的暗区域。根据实验配置，采用了以下方法之一：
- **固定阈值**：使用cv2.threshold()函数并设置cv2.THRESH_BINARY_INV选项，应用一个预定的强度值（例如，在0到255的范围内为50）。强度低于阈值的像素被视为被生物量覆盖的区域。
- **自适应阈值（Otsu法）**：或者，使用Otsu方法（cv2.THRESH_OTSU）自动计算区分生物量与清洁背景的强度双峰分布的最佳阈值，无需手动校准。

**2.5.2 分析区域的空间分割**

由于固定过程仅发生在尼龙网（圆形）的活性区域内，因此定义了一个以图像为中心的圆形掩模，将分析限制在感兴趣区域（ROI）。该掩模是通过cv2.circle()函数生成的，其半径略小于图像宽度的一半，以消除可能引入面积计算误差的无关边界或外部区域。通过对阈值化图像应用cv2.bitwise_and()逻辑运算，最终获得了生物量的分割结果。这种程序可以精确地隔离出有用分析区域内的暗区。

**2.5.3 计算覆盖百分比**

从掩模图像中计算了两个指标：总面积（定义为圆形掩模内的活动像素数量）和暗区（对应于被分类为生物量的像素数量，即在反转掩模中的白色值）。然后，覆盖百分比通过暗区与总面积的比率来确定，并以百分比表示，如公式（2）所示。

**2.5.4 可视化和验证**

该程序包括为每个处理后的图像生成三个可视化面板：原始彩色图像、灰度图像以及使用cv2.addWeighted()将暗区显示为红色的图像。这些可视化结果有助于验证分割效果并准确界定分析区域，同时显示了所使用的阈值、总面积、暗区和覆盖百分比等补充数值结果。

**2.5.5 固定过程变量的趋势分析**

通过最小二乘法线性回归和Mann–Kendall检验分析了吸光度、覆盖百分比和电容力的结果，以建立基于Kendall’s tau ()方向的趋势条件。分析使用了自定义的Python 3.11程序，并采用了NumPy（v1.26）、SciPy（v1.11）和pyMannKendall（v1.4）库。代码可根据要求提供，以确保结果的可重复性。

**3. 结果与讨论**

**3.1 小球藻（Chlorella sp.）的固定**

使用小球藻进行细胞固定过程可以在定义的空间内培养这种微生物，保持其生物活性并增加细胞密度，从而促进物质交换并允许细胞在介质中的重复使用。这证明了混合营养型小球藻种类能够去除废水中的生物和化学污染物，其中微藻细胞会相互黏附并附着在外部表面上[28]。类似地，Hu等人[29]报告称，小球藻与细菌共同培养后的生物量，在聚合物基质中固定或以生物膜的形式附着在固体支撑物上，被广泛用于处理市政、生活和猪废水。当使用微藻种类进行废水处理时，固定方法具有多个优势，包括高去除率、易于控制和增强的生物量积累。

为了提高细胞生长率和生物量生产力，采用了氮补充（0.5 g/L）等培养条件，例如来自N.P.K.肥料（16:16:12）的氮源或生物刺激[30]。这些策略也被认为是大规模藻类生产的低成本替代方案，因为在传统培养基中提供过量营养物质会带来经济挑战[31]。

9.31 L/min的曝气值与生物通风技术相关，该技术增强了微藻生长所需氧气和营养物质的气液质量传输。这显著影响了CO2的传输、营养物质的可用性以及微藻细胞在光照区和暗区中的空间分布，从而影响了光合作用等关键生化反应[32]。持续光照也被认为是基于微藻生物膜培养系统的一个重要因素。对于小球藻 vulgaris而言，已显示出对强光的显著耐受性，这可能是为了抵抗光损伤而产生的保护机制[33]。

**3.2 小球藻（Chlorella sp.）的生长动力学**

在15天的固定过程中，观察到了400–700 nm范围内光谱的变化，如图1所示。吸光度的增加与微藻培养物的光学密度升高以及可见光谱中活性化学物质的产生有关，这些物质包括叶绿素a、叶绿素b及其相关衍生物（如pheopigments a）[34]。这些化合物对于生物量生产、色素保存和早期成岩效应的间接测量具有重要意义[34]。

图1显示了15天固定过程中的400至700 nm的光谱扫描。测量是在10 mL液体悬浮液样品上进行的。图中标出了686 nm处的吸光度峰值。第10天到第15天观察到的平台区域反映了仪器在高细胞密度下的真实响应，由于这种扫描的目的是定性趋势监测而非定量生物量校准，因此样品没有稀释。在图1中可以看到686 nm处的一个特征波长。文献中报道了这个波长是与叶绿素生产相关的主要峰值之一，并且对于量化小球藻 vulgaris [35] 和小球藻 sorokiniana [36] 等物种的浓度特别敏感[36]。

此外，在固定过程的光谱扫描中，686 nm处出现了峰值，显示出与补充了氮和其他营养物质的生物光反应器系统中微藻生长模式一致的规律。Ma和Jian[37]也报告了类似的结果，他们用逻辑模型描述了小球藻 sp. 的生长，显示了光学密度随时间的逐渐增加，并强调了介质pH值、氮浓度、接种浓度和温度等变量的重要性。

图2显示了固定系统中686 nm处的微藻生长动力学。(a) 不同细胞密度下的生长动力学。(b) 第1天的小球藻 sp. 显微图像，对应于(a)中的第一个红色标记。(c) 第15天的小球藻 sp. 显微图像，对应于(a)中的第二个红色标记。对于图2b和c，尽管在固定系统中15天内未观察到微生物的表型变化，但观察到细胞密度和细胞大小的增加。这可能间接反映了培养物中微观粒子的状态、细胞内代谢物的积累以及参与底物转化和能量产生的代谢活动[38]。

通过监测特定波长下的微藻生长动力学，可以估算生物量积累产量，即培养物中细胞总数与单个细胞平均质量的乘积[38]。

**3.3 小球藻（Chlorella sp.）的固定**

固定过程按照第2.3节所述进行，工作体积调整为1.6 L，以覆盖光生物反应器中聚合物基质的整个面积，并使微藻在基质的不同部分黏附，如图3所示。在这项研究中，使用了羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose）通过黏附到聚合物基质（尼龙）上来辅助固定。先前的研究报道了羧甲基纤维素作为微藻种类（如Spirulina maxima和聚集的藻类联合体[39]、小球藻 vulgaris [40]、Lobosphera sp. [41]等）的固定和包封聚合物的用途。这种聚合物通过凝胶化或交联过程使微藻细胞被捕获，并在聚合物的孔隙上形成生物量层[39]。我们在之前的工作中通过SEM显微图证实了小球藻 sp. 在类似条件下的尼龙基质上的结构稳定性[23]，确认固定后的细胞在15天的运行后仍然锚定在聚合物表面上，从而支持了该系统作为此处介绍的监测平台的可靠性。

此外，还采用了图像分析来估计生物量生长，类似于Acevedo等人[42]使用的方法，他们通过将原始颜色（红色、绿色和蓝色）的强度与生物量浓度相关联来计算酵母菌株生长前后的固定率。图像分析结果如图4所示，其中固定区域的空间分割以橙色显示，对应于微藻固定研究中分辨率较高的区域。

图4展示了用于识别细胞密度较高区域的照片分析。每天由三幅图像表示：左侧是固定网格；中间是经过灰度变换的图像；右侧是使用Python程序识别固定区域后处理得到的图像。固定过程剩余天数的额外照片见补充材料（详见补充材料，图S1）。图4显示，随着时间的推移，通过细胞对尼龙基质的黏附，生物量保留逐渐增加。这种行为归因于小球藻 sp. 等物种对亲水材料[43] 和粗糙表面[44,45] 的黏附能力，这两者都有助于介质中的营养扩散和光的穿透。

在微藻生物膜的形成过程中，细胞会产生带负电荷的羧基或磷酸基团、多糖、蛋白质、核酸、脂质和磷脂等化合物，这些化合物在营养交换中起重要作用，并负责细胞的凝聚和黏附[46]。除了通过照片监测间接量化生物量黏附外，还包括用电容量作为监测变量，这对微藻固定的在线控制具有重要意义。与之前估计悬浮微藻生物量的研究类似[47]，这种基于间接信号的技术提供了表示生物量积累的另一种方法。

在这项研究中，系统电容在15天的固定过程中逐渐增加，从第1天的173.3 μF增加到第15天的375.9 μF。图5展示了电容的监测情况。如图5所示，电容与尼龙基质上观察到的生物量积累呈正相关（见补充材料，图S1）。电容的逐渐增加是由生物量生长和固定过程中多种物理化学变化的累积效应驱动的。UT89X数字万用表通过直流充电来测量电容——确定将电路充电到参考电压阈值所需的RC时间常数——因此对系统的整体介电和导电状态敏感[48]。随着微藻生物量和相关生物聚合物（CMC、脂质、多糖和细胞外基质化合物）在尼龙基质上的逐渐积累，以下因素共同导致了观察到的电容增加：(i) 随着细胞消耗营养物质并排出代谢副产物，介质的体积离子导电性发生变化；(ii) 生物污染改变了电极-介质界面的几何形状；(iii) 微藻细胞的固有介电响应，其磷脂膜和脂质体在施加的电场下影响界面极化[49]。这种电容-生物量关系与水下生物膜系统中活细胞密度与测量电容之间的正相关性一致，证实了其作为过程级代理变量的价值[49]。这些结果与保留生物量密度的照片记录一致。因此，结合电学和摄影变量的监测不仅提供了关于生物参数（如细胞数量和活力）的见解，还提供了关于生理参数（如底物浓度、代谢物和潜在产物）的见解。此外，在细胞培养应用中，通常会监测多种物理化学参数，如pH值、温度和渗透压[48]。3.4. 生长过程与固定化过程之间的动态相似性分析为了验证三个独立变量（A、I和C）之间存在共同的动态模式，通过对它们各自的二阶导数进行计算和比较来执行了二阶分析，如图6所示。图6显示了非固定化培养物在684纳米处的吸光度（变量A）、固定化培养物的电容（μF）以及非固定化培养物的电容（μF）随时间的变化的二阶导数。这些导数反映了变化率的加速或减速，从而可以检测到原始数据或一阶导数中不可见的潜在同步性或转变。Górecki和?uczak [50]建议在时间序列评估中使用二阶导数，因为它们提供了关于凹度变化的额外信息，这使得在复杂动态系统中更准确地检测行为模式成为可能。动态时间规整（DTW）算法被应用于二阶导数的时间序列，以量化这些变量之间的相似程度。所得到的DTW距离分别为：DTW(d2I/dt2, d2A/dt2) = 0.53，DTW(d2I/dt2, d2C/dt2) = 1.31，以及DTW(d2C/dt2, d2A/dt2) = 1.52。这些结果证实了变量A和I在其原始行为和二阶动态上具有显著的高相似性。所采用的方法论与Levnaji?和Pikovsky [51]提出的方法一致，他们使用DTW来对齐植物生理反应的时间域，证明了将DTW应用于二阶导数可以改善生物过程之间深层相似性的检测。这种基于加速度的分析能够识别出曲线全局形状之外的关键变化点。二阶导数的绘图曲线进一步强化了这种关系，表明A和I不仅同时增加，还具有相同的拐点和加速模式。相比之下，变量C显示出更明显的偏差和较低的同步性，这表明它可能仍在对同一潜在现象做出反应，尽管存在时间滞后或敏感性降低。这些结果支持了这样的假设：A和I高保真地捕捉到了相同的潜在现象，而C则代表了部分或延迟的反应。这种多层次分析结合了原始值、二阶导数和时间对齐，加强了了一个共同因果事件影响这些变量行为的论点，这也得到了Rastkar等人[52]的认可。3.5. 通过数字图像处理对细胞固定化的光学分析所得结果表明，基于图像捕捉和电容分析的原位固定化技术可以估算微藻的密度。通过颜色分析和区域分割，如图7所示，可以表示固定在固定化基质中的生物量的空间分布。图7显示了2D像素颜色强度（绿色通道，0–255范围内）的地形图，展示了生物量在固定化基质上的空间分布。这些标量场表面图是从数字图像数据计算得出的，并不代表生物膜结构的物理3D扫描。固定化过程的每一天的地图都在补充材料中提供（详见补充材料中的图S2）。对固定化基质的地形强度分析使得附着生物量的空间分布可视化。需要注意的是，这些表面图是2D标量场（绿色通道，0–255范围内）的计算表示，而不是通过CLSM或OCT获得的生物膜结构的物理3D扫描。更高的强度值对应于更强烈的绿色着色，意味着微藻覆盖更密集，每个表面图的高度轴表示局部像素强度的大小，有助于识别出微藻生长和聚合物基质定殖更旺盛的区域。在第一天，观察到形成了一层调节膜，这是在表面浸入培养基后立即产生的，形成了一层离子和有机分子。一旦这层调节膜形成，微生物开始附着[46]，从而增加了尼龙聚合物基质上的固定细胞密度。这里提出的方法相对于传统的生物膜定量技术具有可测量的优势。标准方法如结晶紫染色、菌落形成单位（CFU）平板计数和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）需要破坏样本、化学处理或专用设备，因此不适合实时、非侵入性地监测浸没的固定化系统。相比之下，数字图像分析和电容测量的结合使用可以在不干扰生物膜的情况下连续地进行原位跟踪生物量附着和表面覆盖情况。基于图像的方法提供了尼龙基质上覆盖分布的空间分辨率，而电容则提供了一个对生物量积累引起的系统变化敏感的快速电学代理指标。这种双变量监测策略弥合了破坏性分析方法与可扩展、自动化生物过程控制需求之间的差距，这与过程分析技术（PAT）框架的要求相一致[53,54]。为了用定量指标补充三维分析，计算了覆盖面积，将实验行为与固定化趋势进行了对比。图8展示了15天内小球藻固定化系统的性能，包括其生长曲线、电容和覆盖百分比。图8显示了吸光度、覆盖率和电容的变化趋势。尽管这些变量之间没有直接相关性，但可能存在某种比例关系，从而能够间接监测浸没培养基中微藻的固定化过程，避免生物膜的恶化或脱落。最初，对吸光度、覆盖率和电容进行的最小二乘回归分析显示，Absorbance–Coverage的R2系数为0.78，Absorbance–Capacitance的R2系数为0.89，Coverage–Capacitance的R2系数为0.65。这些值表明这些变量随时间呈现趋势关系。基于这些系数，确定了Mann–Kendall趋势检验统计量的方差关系，结果显示这三个变量之间存在增长趋势，如表1所示。表1显示了Mann–Kendall趋势检验的系数。其中τ-Kendall代表每个变量的趋势方向，p值是检验统计量，当p值低于0.05时，在95%的置信水平下表示统计学显著性，趋势对应于τ-Kendall显著性的分析。选择Mann–Kendall检验是因为它能够评估不同时间序列中趋势的显著性[55,56]。此外，它还被用于生物技术背景下研究浸没系统中的趋势，例如溶解氧、生化需氧量、化学需氧量、氨氮和pH值[57]。根据获得的τ-Kendall值，可以认为每个变量都与其他变量表现出显著的趋势，从而整合了无需侵入性采样或系统干预即可监测细胞固定化的检测技术[53,54]。此外，通过监测特定波长的电学变量（如电容和光学密度），可以实现可重复性、稳健性和可扩展性的条件。4. 结论开发用于细胞培养监测的工具，例如基于电容的跟踪技术，有助于更好地理解生长特性和基质亲和力，并建立和确保可复制、稳健且可扩展的培养体系。研究结论表明，使用电学和光学变量监测小球藻的固定化显示出基于趋势的结果，细胞附着率为24.56 ± 0.61%，并且存在与培养成熟度和细胞繁殖相关的细胞密度较高区域。虽然基于图像的技术提供了尼龙基质内生物量分布的空间细节和信息，但电学电容在大规模控制系统的实施中具有优势，其中快速分析和在线操作是生物过程管理的关键因素。补充材料以下支持信息可以在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/pr14091388/s1。图S1：15天内固定化过程的完整照片记录。每天由三张图像表示：（左）固定化网架；（中）经过灰度转换的图像；（右）使用Python程序识别固定区域的处理图像；图S2：固定化过程每天藻类生物量分布的三维表示。每个面板显示了15天实验期间尼龙基质上生物量的重建空间分布。