《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural and functional analysis of growth differentiation factor 8: A positive regulator of growth in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei
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GDF8基因在太平洋白虾中的功能与分子机制研究揭示了其在肌肉生长和蜕皮调控中的关键作用。该基因在心脏组织高表达，性别和生长阶段差异显著。功能实验表明，敲低LvGDF8抑制生长，过表达则促进生长，与脊椎动物中抑制肌肉生长的保守功能相反。多组学分析鉴定出内质网蛋白加工、二十六烷醇生物合成、Hippo和Rap1信号通路等关键调控网络。
司书青|张晓军|孙建飞|孙文静|钟晓云|孙明哲|胡杰|袁建波|于洋|李世豪|李福华
中国科学院海洋研究所育种生物技术及可持续水产养殖国家重点实验室，中国青岛，266071
摘要
生长分化因子8（GDF8）是肌肉发育、分化和神经发生的关键调节因子，已知其在脊椎动物中抑制肌肉生长。然而，其在甲壳类动物中的功能作用（无论是抑制还是促进）仍存在争议。在本研究中，我们表征了太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）中LvGDF8的结构、系统发育和表达模式。LvGDF8在其他组织中的表达水平相对较低，但在生长迅速的个体和雌性中表达较高，这表明它可能在生长调节中起作用。功能测定显示，敲低LvGDF8显著抑制了体长和体重的增加，而其过表达则增强了生长表现。这些结果表明，LvGDF8在心脏组织中高表达，在L. vannamei中起促进生长的作用，与其在脊椎动物中的肌肉抑制功能相反。整合转录组和蛋白质组分析鉴定了许多与生长和蜕皮过程相关的差异表达基因和蛋白质。随后的生物信息学分析揭示了关键途径的显著变化，包括内质网蛋白处理、蜕皮甾醇生物合成、Hippo和Rap1信号通路。总体而言，这些发现表明LvGDF8在L. vannamei中促进生长，并为GDF8在重要商业甲壳类物种中的分子机制提供了新的见解。
引言
生长分化因子8（GDF8），也称为Myostatin，是一种属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族的分泌信号分子[1]。该超家族包括结构和功能相关的多肽，如TGF-βs、骨形态发生蛋白（BMPs）、活化素、生长分化因子（GDFs）、Nodal和抗苗勒氏管激素/苗勒氏管抑制物质（AMH/MIS）。其中，GDF8/Myostatin、GDF11和某些BMPs被认为是肌肉生长和发育的关键调节因子[2]。激活后，它会抑制关键肌生成调节因子（MRFs）如MyoD、MyoG和MYF5的表达，从而抑制肌肉发育[3]，[4]。GDF8/Myostatin还通过其他机制调节肌肉发育，包括细胞周期控制和蛋白质合成与降解的调节。例如，Myostatin可以通过结合周期依赖性激酶（CDK）启动子来抑制细胞周期进展[5]，并通过PI3K/AKT/GSK-3β信号轴抑制细胞增殖[6]。相反，Myostatin的功能丧失突变会激活Akt/mTOR通路，促进下游关键组分（如Akt和mTOR信号效应物4E-BP1、p70S6K、S6、TSC2）的磷酸化，从而增强蛋白质合成[7]。鉴于肌肉质量对畜牧业和水产养殖物种生产力的直接影响，GDF8/Myostatin作为肌肉生物学的基本调节因子和潜在的遗传改良目标引起了极大的兴趣。
Myostatin在进化上是保守的，在脊椎动物中作为肌肉发育的关键调节因子[8]。在大多数脊椎动物物种中，它作为肌肉生长的负调节因子。在Piedmontese和Belgian Blue等牛品种中，自然发生的myostatin突变导致了明显的肌肉肥大，表现出“双肌”表型[9]。同样，在小鼠中敲除myostatin会导致骨骼肌质量显著增加[10]，而其过表达则导致肌肉萎缩[11]。myostatin的基因编辑一致地增强了哺乳动物的肌肉生长，包括羊[12]、狗[13]、猪[14]和山羊[15]等物种。然而，Myostatin在鸟类和鱼类中的功能表现出显著差异。在鸟类物种中，五种可变剪接变体（myostatin-A至myostatin-E）表现出不同的组织特异性表达模式，其中myostatin-B促进肌母细胞增殖和分化，而myostatin-A则抑制这些过程[16]。在鱼类中，全基因组复制事件产生了具有专门功能的多个Myostatin旁系基因[17]，[18]，[19]，[20]。例如，Myostatin-1抑制了日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）的肌肉细胞增殖[7]，而在斑马鱼中尝试产生“双肌”表型的效果有限[21]。这些种间差异表明，Myostatin的功能在进化过程中并未完全保守。
在无脊椎动物中，GDF8/Myostatin（某些研究中称为Myostatin-like）主要因其对肌肉发育的调节作用而被研究。在巨型淡水虾（Macrobrachium rosenbergii）中，myostatin在腹部肌肉中的表达水平最高[22]。在扇贝（Argopecten irradians）中，它主要在闭壳肌中表达[23]，而在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）中，它在多个肌肉组织中都有强烈的表达，包括爪肌、腿肌、胸肌和心脏[24]。在海参（Apostichopus japonicus）中，myostatin是生长特征的候选基因，特定的单核苷酸多态性（SNPs）与体重显著相关[25]。尽管取得了这些进展，但GDF8/Myostatin在十足类甲壳动物中的功能作用仍存在争议。在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）中，myostatin的表达与生长率呈负相关，其敲低增强了生长表现[26]，[27]。同样，RNA干扰（RNAi）介导的myostatin抑制在M. rosenbergii中促进了肌肉再生[28]，而在香蕉虾（Fenneropenaeus merguiensis）中，较小的个体表现出更高的myostatin表达水平[29]。相比之下，在巨型虎虾（Penaeus monodon）中敲低myostatin/gdfl11会导致生长率降低[30]，而在太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）中，这种敲低会增加死亡率，尽管其对生长的直接影响仍不明确[31]。这些不同的表型结果表明，GDF8/Myostatin在甲壳动物中的调节功能存在显著的物种特异性差异。在考虑将此基因作为水产养殖生长增强的可行目标之前，解决其活性背后的分子机制和环境因素至关重要。
除了其在肌肉稳态中的经典作用外，GDF8/Myostatin似乎还深入参与甲壳动物的蜕皮调节。TGF-β/活化素信号通路在陆地蟹（Gecarcinus lateralis）中间蜕皮阶段的Y-器官（YO）分化中至关重要[32]。在美国龙虾（Homarus americanus）中，myostatin在蜕皮阶段表现出差异表达，并在爪肌萎缩期间调节蛋白质周转[33]。同样，在东方河虾（Macrobrachium nipponense）中，GDF8在蜕皮后早期显著上调，随后随着蜕皮阶段的进展而下降[34]。功能研究进一步揭示了GDF8/Myostatin在蜕皮动态中的不同作用：其敲低在E. sinensis中缩短了蜕皮间隔[35]，而在F. merguiensis[29]和L. vannamei[31]中延长了蜕皮间隔。GDF8/Myostatin是促进还是抑制虾的生长和蜕皮仍有争议。鉴于甲壳动物的体细胞生长与蜕皮紧密相关，并伴随着肌肉质量的周期性重塑，阐明GDF8/Myostatin如何协调生长和蜕皮之间的关系至关重要。
太平洋白虾（L. vannamei）是全球水产养殖中最重要的物种之一。作为生长的关键调节因子，GDF8/Myostatin在甲壳动物中的分子功能和调节机制在很大程度上尚未被探索。在这里，我们首次全面表征了L. vannamei中的GDF8基因。除了描述其基因组结构和时空表达模式外，我们采用了一种多维方法，结合RNAi、重组蛋白注射和4D-DIA蛋白质组学以及转录组学来解码LvGDF8介导的信号网络。这种方法揭示了一组特定的GDF8响应基因和通路，这些基因和通路调控生长和蜕皮之间的相互作用。我们的结果提高了对GDF8如何通过蜕皮相关信号网络调节肌肉重塑的理解，并为甲壳动物特有的生长-蜕皮协调机制提供了新的见解。
章节片段
LvGDF8和GDF8/Myostatin蛋白的基因结构和系统发育分析
从L. vannamei的RNA-Seq数据库中鉴定了四种LvGDF8的可变剪接变体，所有这些变体都映射到同一个基因组位点。其中三种（XM_027379485.1、JQ045427.1和XM_070126322.1）来自NCBI，另一种（LVAN06962）来自L. vannamei基因组数据库。所有异构体都通过RT-PCR和Sanger测序进行了实验验证（补充图1）。LvGDF8-1的全长cDNA为1935 bp，具有660 bp的开放阅读框（ORF）。讨论
在脊椎动物中，GDF8/Myostatin是已知的骨骼肌生长的负调节因子，其功能丧失突变会导致明显的肌肉肥大[1]。GDF8/Myostatin也在各种无脊椎动物谱系中被发现，包括甲壳动物[23]，[30]，[36]。然而，无脊椎动物中GDF8/Myostatin的功能表征仍然相对有限。特别是在对虾中，GDF8/Myostatin的功能作用（无论是作为生长抑制剂还是促进剂）仍不清楚。
结论
总之，本研究提供了L. vannamei中GDF8基因的全面分子和功能表征。我们的发现表明，LvGDF8作为生长的正调节因子，与其在脊椎动物中的经典抑制作用形成了显著的功能差异。通过结合基因组学和转录组学分析、RNAi和过表达实验以及多组学分析的集成方法，我们确定心脏是LvGDF8的主要作用部位。
实验动物
本研究中使用的L. vannamei虾来自日照鸿启水产有限公司。这些虾在自然海水（盐度30 PSU）中以25°C的温度饲养，并每天提供三次商业饲料（烟台戴尔饲料公司）。对于RNAi和蛋白质过表达实验，选择了体重和长度一致的个体。此外，为了评估与生长相关的特征，选择了来自两个特定家族的快速生长和慢生长虾。动物和人权声明
该动物研究已由中国科学院海洋研究所的伦理委员会[2020(37)]审查和批准。我们声明，本研究中的所有动物实验均符合1986年英国动物法案和欧盟指令2010/63/EU的规定。本工作不包含任何涉及人类参与者的研究。CRediT作者贡献声明
司书青：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理。张晓军：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法学、资金获取、概念化。孙建飞：验证、方法学。孙文静：验证。钟晓云：方法学。孙明哲：方法学。胡杰：方法学。袁建波：撰写——审稿与编辑。于洋：撰写——审稿与编辑。李世豪：撰写——审稿与编辑。致谢
本研究得到了国家关键研发计划（2022YFF1000304）、国家自然科学基金（32273102和32573473）、中国科学院战略性重点研究计划（项目编号XDA24030105）和泰山学者计划的支持。本研究还得到了海洋数据中心，IOCAS的支持。
