通过激活Nrf2/GPX4途径抑制铁死亡（Ferroptosis），是人体α1-抗胰蛋白酶（human α1-antitrypsin）发挥广谱心脏保护作用的基础

《International Journal of Biological Macromolecules》：Ferroptosis inhibition via Nrf2/GPX4 activation underlies the broad-spectrum cardioprotection by human α1-antitrypsin

铁死亡抑制剂α1-抗胰蛋白酶通过激活Nrf2/GPX4通路减轻心脏损伤。研究利用CRISPR/Cas9技术构建功能性及突变型SERPINA1基因小鼠模型，证实野生型hAAT通过抑制脂质过氧化和铁积累，经Nrf2依赖性机制上调GPX4、HO-1及xCT表达，显著改善化疗性和缺血性心肌病。突变型hAAT失去保护作用，证实其结构完整性对功能至关重要。

　　

李彦晓|陈宏霞|艾海丹·阿布杜瓦伊提|唐波|江志辉|潘颖|文志英|古丽妮伽尔·图尔洪江|高伟通|郭晓霞|何双双|江文汉|张金英|谢翔|郑颖颖

中国乌鲁木齐新疆医科大学第一附属医院心血管内科

摘要

铁死亡（Ferroptosis）是多种心肌病的重要致病因素；然而，广谱内源性抑制剂的作用机制仍不明确。尽管人α-1-抗胰蛋白酶（hAAT）具有细胞保护作用，但其参与心脏铁死亡的过程尚未被充分研究。为了直接评估内源性hAAT在体内的功能，我们利用CRISPR/Cas9技术构建了表达功能性（SERPINA1^WT）或失活型（SERPINA1^Q129?）hAAT的转基因小鼠模型，并让这些模型暴露于多柔比星诱导的心肌病和心肌梗死环境中。结果显示，SERPINA1^WT小鼠对心脏功能障碍、纤维化和重构具有显著的保护作用，而SERPINA1^Q129?小鼠则没有这种保护效果，这表明保护作用严格依赖于hAAT的生物学活性。这种保护作用是通过抑制铁死亡来实现的，表现为脂质过氧化和铁积累的减少。机制上，内源性hAAT激活了Nrf2信号通路，上调了GPX4、HO-1和xCT等抗铁死亡因子；Nrf2抑制剂ML385能够消除这种保护效果。我们的发现表明，hAAT是一种新型的广谱铁死亡抑制剂，通过Nrf2/GPX4通路发挥作用，为治疗由铁死亡引起的心肌病提供了新的潜在靶点。

引言

多柔比星（DOX）是一种强效的广谱化疗药物，但其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的严重限制，这种毒性可能导致不可逆的心肌病和心力衰竭[1] [2]。同样，急性心肌梗死（AMI）也是全球主要的死亡原因之一，因为急性缺血会导致大量心肌细胞死亡和不良重构，最终引发心力衰竭[3] [4]。因此，阐明共同的病理机制并开发广谱的心脏保护策略具有重要的临床意义。

尽管多柔比星引起的毒性作用与心肌缺血的机制不同，但最新研究表明，多柔比星引起的心肌病（DIC）和AMI具有共同的细胞死亡通路[5] [6] [7] [8]。铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡方式，由脂质过氧化引发，在这两种疾病中均被证实为致病机制[9] [10]。在DIC中，多柔比星破坏了细胞内的铁稳态并抑制了谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达，从而加速了脂质过氧化[11]；在AMI中，铁死亡也显著促进了心肌损伤[12] [13]。因此，针对铁死亡的治疗策略有望缓解多种心脏损伤。

转录因子核因子红系相关因子2（Nrf2）在调节细胞对铁死亡的反应中起关键作用[14]。Nrf2的激活可上调多种抗氧化和铁代谢相关基因，包括GPX4、血红素加氧酶-1（HO-1）、溶质转运蛋白家族7成员11（SLC7A11/xCT）和铁蛋白重链1（FTH1）。这些基因共同抑制脂质过氧化，从而保护细胞免于铁死亡[15] [16]。

人α-1-抗胰蛋白酶（hAAT）由serpin家族A成员1（SERPINA1）基因编码，是一种具有抗炎和强抗氧化特性的循环蛋白酶抑制剂[17] [18]。临床研究表明，血浆中的hAAT具有心脏保护作用，在再灌注期间给药可显著改善心肌损伤的生物标志物[19] [20]。最近的一项研究证实，过表达hAAT的细胞可通过调节FTH1/GPX4通路保护胰腺腺泡细胞免受铁死亡[21]，从而建立了hAAT与铁死亡之间的功能联系。

然而，尽管hAAT在临床上有潜在的保护作用，但其对心肌细胞中铁死亡的保护机制以及Nrf2/GPX4通路的相关性仍不清楚。目前临床策略主要依赖于外源性hAAT的补充，而提高内源性hAAT水平的治疗效果尚未得到证实。基于这些假设，我们推测内源性hAAT通过激活Nrf2/GPX4通路来减轻心肌细胞的铁死亡和相应的心脏损伤。为了直接评估hAAT的功能，我们利用CRISPR/Cas9技术构建了表达功能性野生型或失活型hAAT的转基因小鼠模型。本研究旨在：（1）系统探讨内源性hAAT在缓解DIC中的作用及其机制，重点关注Nrf2/GPX4–铁死亡通路；（2）在AMI模型中验证内源性hAAT的保护效果，以验证这一机制的普遍性。

材料与方法

多柔比星（DOX）购自Solarbio（北京，中国）；hAAT购自Sigma-Aldrich（美国）；Fer-1购自Selleck（德国）；ML385购自GLPBIO（中国）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素购自Gibco（美国）。根据制造商说明使用以下商业检测试剂盒：小鼠脑利钠肽（BNP）ELISA试剂盒（Cusabio，美国）；小鼠肌酸激酶（CK）

内源性hAAT以依赖野生型结构的方式保护DIC小鼠免受心脏功能障碍

为了研究内源性hAAT的功能，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了表达野生型（SERPINA1^WT）或失活型突变体（SERPINA1^Q129?）hAAT的小鼠模型（见图S1A、B）。基因分型（图S1C）证实，通过连续杂交杂合F1后代获得了纯合子小鼠。Sanger测序进一步确认了突变体中的Q129*突变（c.385C>T, p.Gln129*）

讨论

我们的研究不仅确认了hAAT是一种新型的铁死亡抑制剂，更重要的是，阐明了其心脏保护作用的两个基本原理：功能依赖性和广谱有效性。SERPINA1^WT小鼠的显著保护作用与SERPINA1^Q129?突变体完全缺乏保护作用之间的明显差异提供了直接的遗传证据，表明抗铁死亡和心脏保护功能严格依赖于hAAT的分子结构和功能

结论

本研究表明，hAAT是一种重要的广谱铁死亡抑制剂，在心脏中通过激活Nrf2/GPX4通路和调节铁代谢来发挥保护作用，其保护效果严格依赖于其野生型结构。这一发现不仅扩展了hAAT的功能范围，还为治疗由铁死亡引起的心肌病提供了新的治疗途径

作者贡献声明

李彦晓：软件开发。陈宏霞：数据整理。艾海丹·阿布杜瓦伊提：方法学设计。唐波：方法学设计。江志辉：方法学设计。潘颖：项目监督。文志英：资源协调。古丽妮伽尔·图尔洪江：数据分析。高伟通：方法学设计。郭晓霞：项目管理。何双双：资源支持。江文汉：概念提出。张金英：撰写、审稿与编辑。谢翔：撰写、审稿与编辑。郑颖颖：撰写、审稿与编辑、项目监督及资金支持

资助来源

本研究得到了以下机构的支持：国家自然科学基金区域项目（批准号：82460048）；新疆维吾尔自治区自然科学基金（批准号：2022D01E70、2024B03036-2）

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。

致谢

李彦晓和陈宏霞对这项工作贡献了同等的工作。我们感谢新疆医科大学第一附属医院和郑州大学第一附属医院心血管内科提供的临床支持，同时也感谢新疆高发疾病研究重点实验室和河南省心脏损伤修复重点实验室的实验帮助。