机械力诱导的人类机械敏感性离子通道TMEM63A的构象变化

《Chinese Journal of Physics》：The mechanical force-induced conformational changes of human mechanosensitive ion channel TMEM63A

本研究通过分子动力学模拟解析人类机械敏感离子通道hTMEM63A的机械门控机制，发现膜张力主要影响通道上端门控结构，而非锥形脂质（如LPC）插入可改变下端门控构象，促进通道扩张。为少突胶质细胞脑白质营养不良的靶向治疗提供理论依据。

　　

本宇山|张一鸣|郭伟伟|于华|王大立

滨州医学院基础医学科学学院，烟台，264003，中国

摘要

机械感觉能力被认为是生物功能的关键方面，并参与多种生理过程。机械敏感（MS）离子通道对于机械信号的跨膜传递至关重要。其中，TMEM63是一种在人类中存在的MS通道家族，已被发现与低髓鞘形成性白质营养不良（HLDs）有关。尽管在HLDs患者中检测到了多种TMEM63突变，但其潜在的激活机制尚未被阐明，这给这些疾病的临床干预带来了重大挑战。在这项研究中，我们对人类TMEM63家族的特定成员hTMEM63A进行了分子动力学（MD）模拟，以阐明该通道如何响应膜双层的机械力变化。我们的结果表明，机械力主要影响hTMEM63A的上部通道门，而额外的非圆锥形脂质分子（例如LPC）的插入则会影响下部通道门的构象，可能有助于通道进一步扩张。这些发现直接证明了hTMEM63A对膜力的动态响应，并阐明了特定脂质相互作用的作用，为人类TMEM63家族的通道门控机制提供了宝贵的见解，为HLDs的未来治疗策略提供了信息。

引言

机械敏感（MS）离子通道作为力-电转换器，在原核和真核生物中普遍存在[1]。在植物中，渗透压敏感的钙通透通道（OSCA）被认定为MS通道，它们在多种生物过程中起着关键作用，包括自我保护、渗透调节和本体感觉[2]。最近确定的OSCA结构表明OSCA采用二聚体构象[3]，[4]。跨膜蛋白63家族（TMEM63），作为哺乳动物中的OSCA同源物，也能够响应机械刺激[5]。与OSCA不同，TMEM63被认为以单体形式运作，并与OSCA的单个亚基具有相似的架构框架[5]，[6]。这种结构相似性导致了一种假设，即OSCA和TMEM63通道是由嵌入的脂质双层产生的力激活的，这通常被称为“来自脂质的力”原理[7]。遵循“来自脂质的力”原理的通道，如TRAAK、TREK、MscL、MscS和PIEZO通道[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，通过周围力的变化和特定脂质分子的插入来控制通道的开启。也有报道指出OSCA/TMEM63可以在压力处理和脂质结合时被激活[5]，[6]。然而，机械力如何传递到OSCA/TMEM63并引起孔径扩张的详细机制仍需进一步研究。

TMEM63通道已被确定为神经发育中的关键参与者，TMEM63的功能障碍与低髓鞘形成性白质营养不良（HLDs）有关，这是一种典型的神经发育障碍（NDD），其特征是大脑发育延迟和认知障碍[15]，[16]。临床上，受影响的个体在运动技能和语言表达方面存在显著缺陷[17]。先前的临床研究报道了HLD患者中存在TMEM63A变异体，确立了TMEM63A突变与HLDs临床表现之间的直接关联[18]，[19]。最近，确定了TMEM63A变异体V44M的冷冻电镜（cryo-EM）结构[20]，为TMEM63A的通道门控机制提供了见解。值得注意的是，大多数致病突变位于TMEM63A的通道孔内，这些残基的侧链朝向离子传导路径。可以推测，这些残基特性的改变可能会影响TMEM63A的通道门控机制。然而，这些残基对通道功能的具体影响尚未完全阐明。

为了研究这些突变残基与相关疾病之间的潜在机制联系，研究野生型TMEM63A对膜力变化的机械响应至关重要。分子动力学模拟在研究病理脂质与模型膜之间的分子水平相互作用方面越来越不可或缺，而传统的实验生物物理技术在这方面存在显著限制。虽然荧光显微镜、NMR、SAXS/WAXS和Langmuir单层等方法可以提供有价值的集合平均数据，但它们在创建含有瞬态圆锥形脂质（如LPC）的稳定、不对称模型膜时遇到困难，因为这可能会导致整体不稳定。这些技术还缺乏捕捉瞬态插入轨迹、特定头基团相互作用或叶片特异性效应的空间和时间分辨率。全原子分子动力学模拟可以追踪由脂质结合或双层张力引起的离子通道关键构象变化[9]，[10]，[21]，[22]，从而能够在原子分辨率下系统地研究机械敏感离子通道的门控机制。因此，MD模拟作为一种强大的工具，可以生成机制假设并指导针对性实验。计算机硬件的最新发展以及模拟算法的优化[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]使我们能够进行分子动力学（MD）模拟，以分析人类TMEM63A（hTMEM63A）的门控机制，特别是当对脂质双层施加机械力时这些形成孔道的螺旋的构象变化，这直接导致hTMEM63A的孔径扩张。初步研究结果[31]表明，位于TMEM63A形成孔道的螺旋附近的S538-E539-I542和D189-N190-D191处的两个LPC结合位点，在存在圆锥形脂质（如LPC）的情况下可能会引起疏水不匹配，从而促进MS通道的门控。在模拟中使用超过典型水平的LPC浓度（4:1）旨在快速识别结合位点。先前的实验使用了50 mN的力，而这里的模拟保持了这一环境变量，以确保与以往工作的一致性和早期发现的可应用性。我们的MD结果揭示了与hTMEM63A离子通道开启相关的两个关键区域：第一个区域位于孔道的顶部入口，其中分布有多种疏水残基；另一个区域由残基W473调节，该残基位于hTMEM63A孔道的底部入口，面向离子传输路径，W473已被证明是OSCA/TMEM63中的脂质结合残基[5]，[32]，[33]。我们的MD结果表明W473充当hTMEM63A孔道的下部开关。W473的芳香环与脂质头基团相互作用，并锁定hTMEM63A的基态孔道。在hTMEM63A激活过程中，W473逐渐从传输路径旋转开来，促进水分子从底部入口进入hTMEM63A孔道区域，从而导致孔径进一步扩张。这些MD结果增强了我们对hTMEM63A激活机制的详细理解，为针对HLDs的靶向药物开发和后续临床治疗提供了合理的基础。

部分摘录

模拟系统设置

hTMEM63A具有单体架构，主要由跨膜螺旋-4（Helix-4）和跨膜螺旋-6（Helix-6）形成其离子传导孔道，在上部路径中分布有多种疏水残基（图1A）。为了研究溶血磷脂酰胆碱（LPC）对hTMEM63A的影响，我们构建了两个主要的hTMEM63A-双层系统：一个包含嵌入纯DPPC双层中的hTMEM63A（称为Pure，见图1B），另一个由DPPC双层和LPC组成

讨论

这些结果表明，膜张力处理迫使hTMEM63A的形成孔道的螺旋相互倾斜和分离，导致这些螺旋进一步断裂，这与hTMEM63A的门控机制密切相关。这一现象与其他MS通道观察到的“来自脂质的力”激活原理一致[34]，[35]。值得注意的是，我们观察到hTMEM63A的Helix-4的运动最为显著，因为它靠近脂质双层。

结论

总体而言，这些发现将“来自脂质的力”原理与特定脂质结合结合起来，阐明了hTMEM63A的激活机制。我们提出了一种模型，其中非圆锥形脂质（如LPC）通过插入脂质双层并破坏细胞内通道门来诱导离子通道的别构启动。随后施加的膜张力有效地破坏了剩余的细胞外通道门，这一过程由侧链旋转促进

模拟系统设置

所有模拟都是在Gromacs 2020.5分子动力学引擎下进行的[46]。最近确定的hTMEM63A（PDB ID：8GRS）结构从蛋白质数据库下载[5]，作为MD模拟的初始结构。通过web服务器CHARMM-GUI[47]，[48]构建了两种具有不同脂质组成的hTMEM63A-双层系统：一个双层仅包含1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC），另一个双层由DPPC和溶血磷脂酰胆碱（LPC）组成

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者贡献

D.W.和H.Y提出了这个想法并监督了项目。B.S进行了分子动力学模拟并分析了模拟轨迹。B.S、Y.Z、W.G和D.W撰写了原始手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。

CRediT作者贡献声明

本宇山：撰写——原始草稿，可视化，软件，方法学。张一鸣：方法学，数据管理。郭伟伟：撰写——原始草稿。于华：监督，项目管理。王大立：撰写——原始草稿，监督，项目管理，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。

作者是该期刊的编辑委员会成员/主编/副主编/客座编辑，未参与本文的编辑审查或发表决定。