《ACS Catalysis》：Biocatalytic Upcycling of Biomass via Immobilized Enzymes in Continuous Flow
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本文报道了一种创新的生物催化连续流系统，用于高值化利用农业废弃生物质。研究聚焦于糖基废弃物（如甜菜粕）中未被充分利用的糖醛酸资源，通过融合纤维素结合域（CBD）工程化改造的糖醛酸脱氢酶（Udh）和烯还原酶（ER），并将其高效共固定于纤维素载体上，构建了模块化固定化酶级联反应体系。该系统在温和水相条件下实现了对糖醛酸的高效转化（>95%），并可连续运行多个循环保持活性。通过整合在线辅因子（NAD+）再生与产物萃取，实现了克级规模聚合物前体（分离收率高达97%）的高效生产。所得二酸与内酯产物可进一步转化为（聚）酯和（聚）酰胺，在生物塑料、表面活性剂和功能材料领域具有应用潜力。此模块化、可扩展的连续流生物催化策略，为富含糖醛酸废弃物的高值化利用及生物制造提供了通用性新路径。
每年，大量的甜菜在制糖后会产生数以万吨计的副产品——甜菜粕。目前，这些甜菜粕通常被简单加工为低价值的动物饲料，其蕴含的宝贵化学资源未被充分利用。甜菜粕富含果胶，而果胶中近一半的成分是d-半乳糖醛酸，这是一种具有高价值转化潜力的糖醛酸。如何将这类农业废弃物“变废为宝”，转化为高附加值的化学品和材料，是实现可持续发展和循环经济的关键挑战之一。传统的化学转化方法往往条件苛刻、步骤繁琐且不够环保。而生物催化，特别是酶催化，因其高选择性、高效率及在温和条件下反应的优势，被视为一种极具前景的绿色转化途径。然而，游离酶的成本高、稳定性差、难以回收再利用等问题，限制了其大规模工业应用。同时，如何将酶催化与高效、可放大的连续流反应器技术相结合，也是实现生物制造产业化必须跨越的障碍。本研究正是在此背景下，探索了一条融合酶工程、固定化技术与连续流工艺的创新路径，旨在为糖基生物质废弃物的高值化利用提供一套高效、稳定且可扩展的解决方案。相关研究成果发表在催化领域知名期刊《ACS Catalysis》上。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：首先，采用分子对接（Docking）和酶工程（如点突变）对糖醛酸脱氢酶（AfUdh）进行理性设计与改造，以拓展其底物谱。其次，利用合成生物学（Biobrick）策略，将不同的纤维素结合域（CBDs）通过柔性或半刚性连接肽与目标酶（AfUdh、NCR等）进行融合表达。再者，系统筛选与评价了包括搅拌釜、管式流、分段流、微型连续搅拌釜（mCSTR）、磁泰勒涡流（mTVR）及填充床（PBR）在内的多种反应器构型，以优化反应流体力学与传质。最后，建立了基于纤维素（如竹纤维素）载体的酶固定化平台，并开发了集成了在线产物萃取和酸催化环化的连续流反应系统，用于克级规模的合成。
氧化d-半乳糖醛酸及其类似物
研究人员首先致力于将来源于甜菜粕的d-半乳糖醛酸转化为有价值的产物。他们选择了来自根癌农杆菌的糖醛酸脱氢酶（AfUdh），并引入了源自运动发酵单胞菌的烯还原酶（NCR）构建辅因子（NAD+）再生系统，以解决反应监测中信号重叠的问题。研究发现，AfUdh能在4小时内完全转化d-半乳糖醛酸，主要产物为d-半乳糖二酸-1,4-内酯及其水合产物黏酸，实现了“一锅双产物”（糖二酸/内酯与手性合成子）的合成策略。此外，AfUdh也能完全转化其异构体d-葡萄糖醛酸。通过计算机模拟对接分析，研究人员发现AfUdh活性位点的Arg172残基对底物识别至关重要，并据此设计了突变体（如172Q），成功将酶活性拓展至部分其他已糖（如葡萄糖、半乳糖），尽管转化率有所差异。
反应器构型的评估
当反应规模从毫克级放大到毫摩尔级时，产率出现下降，表明过程可能受流体力学和传质限制。为此，研究团队系统筛选了多种反应器构型。结果发现，与简单的搅拌釜批次反应相比，强化混合的构型如微型连续搅拌釜反应器（mCSTR）和磁泰勒涡流反应器（mTVR）能提升产率10-15%。而采用表面固定化策略的填充床反应器（PBR，使用Ni-NTA填料）表现优于传统的包埋法（如海藻酸钙微球），证实了表面固定化在维持酶可及性和稳定性方面的优势。这为后续转向更刚性、可持续的纤维素载体奠定了基础。
基于CBD的酶固定化技术开发AfUdh反应
研究人员探索了利用纤维素结合域（CBD）将酶固定于纤维素载体上的策略。他们测试了五种不同的CBD，并将其与显色蛋白或目标酶融合。实验表明，来自热纤梭菌的CBD3（CBM2a）和来自热解纤维素厌氧菌的CBD4（CBM3a）在竹纤维素上表现出最强的结合能力和最低的浸出率。动力学研究表明，与游离酶相比，CBD融合的AfUdh和NCR的催化效率（kcat/Km）有显著提升（2-4倍），这可能与CBD结构域增加了酶的溶解度有关。然而，将CBD3-NCR固定化后，其活性完全丧失，计算机模拟显示纤维素表面可能阻塞了其活性位点。为此，研究人员截短了CBD3，创建了CBD6变体，成功解决了空间位阻问题，使固定化后的CBD6-NCR恢复了良好的活性。回收实验表明，固定化的CBD-AfUdh在8个循环后仍能保持超过95%的活性，而共固定化的CBD-AfUdh和CBD6-NCR体系也表现优异。此外，冻干后于4°C储存的固定化酶在90天后仍能保持完全活性，展现了极佳的储存稳定性。
利用CBD固定化酶进行克级规模连续流生产
在建立CBD固定化方法后，研究在克级规模上进行了验证。将CBD3-AfUdh和CBD6-NCR的细胞裂解液共固定于装有竹纤维素的柱中，构建了填充床连续流反应系统。反应物料与有机溶剂（乙酸乙酯）并行泵入，实现在线萃取。以12.5毫摩尔的d-半乳糖醛酸为底物，经过5小时反应，最终以93%的分离收率得到1.3克烯还原产物（高对映体过量值），并以97%的分离收率得到2.1克黏酸。以d-葡萄糖醛酸为底物时，酶促氧化产物可在反应后在线酸化，定量转化为双内酯（一种异山梨醇类似物）。该系统还被成功应用于其他底物组合，高效生产了多种高附加值手性合成子和糖衍生化合物，证明了该平台的通用性和可扩展性。
产物4a和7b的应用
研究最后探索了黏酸（4a）和双内酯（7b）的升级利用潜力。通过费歇尔酯化反应，黏酸可与多种醇（如1,4-丁二醇、丁醇等）反应，以良好收率（68-88%）生成聚酯或酯类化合物。而双内酯则可与多种胺（如乙二胺、苄胺等）在温和条件下快速反应，生成聚酰胺或酰胺类化合物。这些产物在生物塑料、表面活性剂及3D打印共聚物等领域具有潜在应用前景。
本研究成功建立了一个环境友好的化学酶促级联连续流体系，用于将生物质衍生的d-半乳糖醛酸或d-葡萄糖醛酸高效转化为高附加值化合物。该体系的核心是CBD介导的酶固定化“双产物”策略，可同时生产手性合成子与糖衍生二酸或双内酯。CBD固定化显著增强了酶的活性和稳定性，而计算机模拟指导的连接肽与CBD取向设计对维持催化功能至关重要。该模块化连续流系统能够实现克级规模生产，并获得高分离收率和高对映选择性，其体积产率较批次系统有显著提升。研究还展示了产物在合成（聚）酯和（聚）酰胺方面的应用潜力，为利用可再生废弃物可持续生产生物聚合物提供了新途径。然而，当前体系受底物浓度上限（主要由于共底物抑制）和纤维素载体力学性能的限制。未来通过集成非变形刚性载体（如可控孔径玻璃）和改进辅因子再生策略，有望进一步提升该平台的体积生产效率和工艺强度，推动其从实验室规模向更高浓度的生产过程迈进。这项研究为生物质废弃物的资源化利用和绿色生物制造提供了具有广泛适用性的创新思路和技术方案。
