《ACS Omega》：Synthesis and Biological Evaluation of Modified Peptide Derivatives Targeting the SARS-CoV-2 Nsp3 Macrodomain (Mac1) Replication Domain
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为解决现有SARS-CoV-2 Nsp3(Mac1)抑制剂实验验证不足的问题，研究者设计合成了含疏水及带正电氨基酸残基的改性肽衍生物(D1–D15)，通过分子模拟与细胞复制子实验，证实组氨酸侧链增强活性，其中D15抑制病毒复制活性最强(IC50=22.2 μM)，且安全性良好，为抗冠状病毒肽类药物研发提供了新线索。
自2019年底新冠肺炎疫情（COVID-19）爆发以来，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引发的全球大流行给人类公共卫生安全带来了前所未有的挑战。尽管疫苗的研发和投入使用有效控制了重症率和死亡率，且以奈玛特韦（Nirmatrelvir，即Paxlovid的活性成分）为代表的小分子药物也已获批临床使用，但面对持续出现的病毒变异（如Omicron等变异株），以及部分地区疫苗接种率不均、药物可及性受限等问题，针对SARS-CoV-2的新型抗病毒药物，尤其是具有新作用机制、新结构骨架的候选药物，依然有着迫切的研发需求。
在SARS-CoV-2的生命周期中，病毒利用宿主细胞的机制进行大量蛋白质的合成与加工。其中，非结构蛋白3（Nsp3）是冠状病毒编码的最大且多结构域的蛋白质，它不仅作为病毒复制转录复合体（RTC）的支架与其他病毒非结构蛋白（Nsps）及宿主蛋白相互作用，还包含多个具有特定功能的结构域。特别值得关注的是Nsp3中的宏域1（Macrodomain 1，简称Mac1）。Mac1具有单（ADP-核糖）水解酶活性，能够移除宿主蛋白上的ADP-核糖修饰（例如由PARP14引入的修饰）。由于这种修饰与宿主免疫反应的调节密切相关，且Mac1在相关冠状病毒的毒力中发挥重要作用，该靶点被认为是极具潜力的抗病毒治疗靶标。
然而，审视当前的抗病毒药物研发现状，虽然已有大量研究聚焦于理论上识别潜在的化合物和化学骨架（主要依赖于计算机模拟即“in silico”方法和高通量筛选），但经过实验验证且具有高抑制效力的Nsp3（Mac1）抑制剂仍然相对有限。为了填补这一空白，研究人员开展了一项针对SARS-CoV-2 Nsp3 Mac1靶点的改性肽衍生物的设计、合成及生物评价研究，相关成果发表在《ACS Omega》上。该研究成功合成了一系列含有疏水性（苯丙氨酸和色氨酸）和带正电荷（组氨酸）氨基酸残基的改性肽衍生物（D1–D15），通过分子建模预测其结合能力，并利用基于细胞的SARS-CoV-2复制子系统评估了其抗病毒复制活性。结果显示，含有组氨酸侧链的化合物表现出更高的生物活性，其中化合物D15表现出了最 potent的病毒复制抑制能力（IC50= 22.2 μM），且这些化合物在健康细胞系中未表现出明显的细胞毒性，表明了良好的安全性。这一研究不仅揭示了组氨酸残基在靶向Mac1中的关键作用，也为后续开发基于多肽的抗SARS-CoV-2及其他具有相似复制机制的冠状病毒药物提供了有价值的先导化合物。
为开展上述研究，作者主要采用了以下关键技术方法：通过有机合成两步法（酯转化为N-甲基酰胺，再与羧酸衍生物偶联）制备了15种改性肽衍生物(D1–D15)；使用Schr?dinger软件包（Glide模块）进行分子对接（Molecular Docking），并基于PDB ID: 7KQP结构进行回顾性验证；利用Desmond模块进行250 ns的分子动力学（MD）模拟及MM-GBSA结合自由能计算以评估动态结合稳定性；采用MTT法评估化合物在健康细胞系（CCD-1079Sk）及模型细胞系（Caco-2）上的细胞毒性；利用携带荧光素酶报告基因的SARS-CoV-2亚基因组复制子颗粒（ΔS-VRP系统）在Caco-2细胞中评估化合物对病毒RNA复制的抑制活性，并通过剂量梯度实验计算IC50值。
1. Introduction（引言）
研究背景指出SARS-CoV-2是具有包膜、正链、单股RNA的β冠状病毒，其约30 kb的基因组编码多个非结构蛋白，其中Nsp3是最大的多结构域蛋白，其包含的Mac1域因可水解ADP-核糖、调节宿主免疫及关联病毒毒力而成为有前景的治疗靶标。作者梳理了现有针对SARS-CoV-2的抑制剂（如基于statine、四肽拟肽类及奈玛特韦等）以及靶向Nsp3(Mac1)的报道（如azoindole衍生物、吡唑啉类化合物及晶体学筛选发现的抑制剂），指出当前大量研究仍停留在理论识别和初步筛选阶段，经过实验验证的高效力抑制剂仍有限，从而引出本研究旨在设计、合成并评价新型化合物。
2. Results and Discussion（结果与讨论）
2.1. Chemistry（化学合成）
研究通过两步法成功合成了一系列带有疏水性（苯丙氨酸、色氨酸）和带正电（组氨酸）氨基酸侧链的肽类化合物（D1–D15）。第一步是将氨基酸酯在33%甲胺溶液中反应48小时，转化为N-甲基酰胺（A–C）；第二步是在DCC、DIPEA和HOBt存在下，于DMF中室温偶联得到目标衍生物D1–D15。所有中间体及终产物的结构均通过1H NMR、13C NMR及高分辨质谱（HRMS）进行了确证。
2.2. Molecular Modeling Studies（分子建模研究）
2.2.1. Validation（验证）
选取SARS-CoV-2 Nsp3(Mac1)晶体结构（PDB ID: 7KQP），将共结晶配体ADP-核糖回 dock 至结合口袋，所得构象与原始共结晶构象非常接近（RMSD: 1.42 ?），证实了对接模型的可靠性。随后对共结晶复合物进行250 ns MD模拟，显示配体与Asp22、Ile23、Ala38、Val49、Gly130、Ile131、Phe132等关键残基形成持久氢键，配体RMSD稳定低于2 ?，蛋白骨架RMSD约1.5–2.0 ?，MM-GBSA平均结合自由能约为?85 ± 6 kcal/mol，验证了体系稳定可靠。
2.2.2. Molecular Docking Studies（分子对接研究）
对D1–D15进行对接，筛选出D13、D14、D15作进一步MD模拟。D13对接得分?9.452 kcal/mol，与Ala38、Ala39、Val49、Ser128、Ala129形成氢键，其组氨酸部分与Phe132发生π–π堆积；D14得分?10.693 kcal/mol，与Ala39、Val49、Ala50、Ser128主链及Asn40侧链成氢键，组氨酸与Phe132 π–π堆积；D15得分?10.064 kcal/mol，与Ala39、Val49、Ser128、Ala129主链成氢键，组氨酸与Phe132 π–π堆积。
2.2.3. MD Simulations（分子动力学模拟）
对Nsp3(Mac1)-配体复合物进行250 ns MD模拟：D13复合物中，配体保留与Ala39、Val49、Ser128、Ala129的氢键，新增与Ile131氢键，配体RMSD 0.5–2.20 ?，蛋白骨架RMSD 1.25–2.30 ?，平均ΔGbind约?72 ± 5 kcal/mol；D14复合物中，初始部分氢键断裂，新增与Ala129、Ile131氢键，保留与Phe132 π–π堆积并新增与Phe156 π–π堆积，配体RMSD约3.6–4.2 ?，蛋白骨架RMSD 1.25–1.50 ?，平均ΔGbind约?70 ± 6 kcal/mol；D15复合物中，保留部分氢键并新增与Ser128的另一氢键，保留与Phe132 π–π堆积并新增与Phe156 π–π堆积，配体RMSD稳定在2.4–2.8 ?，蛋白骨架RMSD 2.0–2.4 ?，平均ΔGbind约?70 ± 8 kcal/mol。
2.2.4. Evaluation of Synthesized Compounds for Their Inhibitory Effects on SARS-CoV-2 Replicon Replication（合成化合物对SARS-CoV-2复制子复制抑制效应的评价）
细胞毒性实验显示，大部分化合物在健康细胞系（CCD-1079Sk）中IC50> 200 μM，仅D5和D11 IC50分别为89.99 ± 34.83 μM和154.62 ± 32.49 μM，表明总体安全性良好。选用Caco-2细胞及SARS-CoV-2亚基因组复制子（ΔS-VRP）系统进行抗病毒评价，在50 μM浓度下，D6、D7抑制较弱，而D12、D14、D15抑制率超50%。进一步剂量实验测定IC50：D12为117.8 μM (95% CI: 86.5–188.8 μM)，D14为61.2 μM (95% CI: 39.2–143.9 μM)，D15为22.2 μM (95% CI: 15.4–35.7 μM)。结构-活性关系分析表明，组氨酸残基通过与Phe132作用提升活性；对比D12（含嘧啶环）、D14（含苯并呋喃环）、D15（含甲基吲哚环），后者两个较大疏水环系增强口袋内相互作用，且甲基吲哚环电子更丰富并能作为氢键供体，使D15活性优于D14。
3. Conclusion（结论）
研究成功设计合成了含疏水（苯丙氨酸、色氨酸）和带正电荷（组氨酸）氨基酸残基的改性肽衍生物D1–D15。分子建模表明D13、D14、D15对Nsp3(Mac1)活性位点具有中高等亲和力；生物活性评价证实D15抑制SARS-CoV-2复制子复制最强（IC50=22.2 μM），D14次之（IC50=61.2 μM），且化合物在健康细胞系中无显著细胞毒性。组氨酸侧链通过与Phe132作用提升生物活性。D14和D15可作为靶向SARS-CoV-2及潜在其他相似复制机制冠状病毒的肽类抑制剂先导化合物。
4. Experimental Section（实验部分）
详细描述了材料来源、核磁共振与质谱等仪器信息；给出了中间体A–C及终产物D1–D15的具体合成步骤、纯化方式及波谱数据；说明了分子对接与MD模拟的详细参数（如Schr?dinger软件、OPLS4力场、Glide SP模式、Desmond模拟条件等）；以及细胞毒性MTT assay、SARS-CoV-2亚基因组复制子构建（ΔS-Luc-GFP bacmid与VSV-G共转染Huh7细胞）和在Caco-2细胞中感染处理与荧光素酶检测的实验操作流程。
总体而言，该研究通过合理的药物化学设计、系统的分子模拟及可靠的细胞水平抗病毒评价，明确了特定氨基酸残基（组氨酸）及疏水环系（甲基吲哚）在靶向SARS-CoV-2 Nsp3(Mac1)中的重要性，获得的先导肽类分子D14和D15在微摩尔浓度下即可有效抑制病毒复制且安全性较好，为抗冠状病毒多肽药物的研究提供了重要的结构信息与实验依据。
