新型冠状病毒SARS-CoV-2刺突蛋白的电化学检测：通往大流行诊断的一条快速有效途径

《ACS Omega》：Electrochemical Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein: A Fast and Effective Pathway to Pandemic Diagnostics

针对COVID-19大流行期间亟需快速、可靠的病毒诊断工具的挑战，研究人员开发了一种基于链霉亲和素修饰的丝网印刷碳电极（SPCE）和适配体（Aptamer 3）的新型、无标记电化学适配体传感器，用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白。该传感器表现出0.05至5 μM的线性检测范围、8.03 μA μM–1的灵敏度、高达10%的标准偏差的高重现性以及0.48 μM的检测限，为快速、低成本的病毒检测提供了一个有前景的概念验证平台。

　　

2019年末出现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）所引发的COVID-19大流行，深刻改变了全球公共卫生格局，截至2024年11月，已导致全球超过700万人死亡。疫情的快速蔓延暴露了现有诊断方法的局限性，急需开发快速、可靠且可及的检测工具。目前，病毒检测的金标准是逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），但其成本较高，且病毒变异（如阿尔法、贝塔、德尔塔、奥密克戎等）可能导致检测准确性下降。免疫学方法如酶联免疫吸附试验和侧向流动免疫分析法也存在类似挑战。因此，研究者们将目光投向了电化学传感器，这类技术有望克服上述缺点，提供一种高性价比、快速、且便于在护理点（Point-of-Care, PoC）使用的诊断方案，契合世界卫生组织（WHO）提出的ASSURED（敏感性、特异性、可负担性、可及性、易用性、快速性、稳健性、设备无依赖性）标准。

在此背景下，一项旨在开发一种新型、快速、低成本的电化学适配体传感器的研究应运而生，其成果发表在《ACS Omega》期刊上。这项研究提出了一种无标记的电化学适配体传感器，作为检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白的概念验证平台。研究人员利用链霉亲和素与生物素之间强大的相互作用，将特异性识别SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（Receptor-Binding Domain, RBD）的适配体固定在电极表面，从而构建了一个简单高效的检测系统。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几种关键技术方法：首先，使用链霉亲和素修饰的丝网印刷碳电极（Streptavidin-modified Screen-Printed Carbon Electrode, SPCE-str.）作为传感平台。其次，合成了三种不同的生物素化适配体（Aptamer 1, 2, 3），并通过链霉亲和素-生物素结合将其固定于电极表面。研究对SARS-CoV-2刺突蛋白样本进行了系列浓度稀释。最后，采用多种电化学表征技术对传感器性能进行全面评估，包括用于测定电极活性表面积和反应机制的循环伏安法（Cyclic Voltammetry, CV），用于分析界面电荷转移过程的电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS），以及用于定量检测靶蛋白浓度的差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry, DPV）。此外，还利用原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）对电极修饰前后的表面形貌进行了表征。

研究结果

3.1. 活性表面积测定

通过循环伏安法（CV）和Randles–?ev?ik方程计算了电极的活性表面积。结果显示，裸露的SPCE活性表面积为0.17 cm²，经链霉亲和素修饰后（SPCE-str.）略微增加至0.18 cm²。而适配体固定后，由于生物分子的空间位阻效应，活性表面积减小（Aptamer 1, 2, 3分别对应0.16, 0.16, 0.17 cm²）。其中，条形图显示，在三种适配体中，基于Aptamer 3修饰的电极（SPCE-str./apt.3）显示出最高的电流响应（0.134 mA），且在与SARS-CoV-2刺突蛋白结合后，其电流响应下降最为显著，这表明Aptamer 3的性能最优。这一结论在 的循环伏安图中也得到了印证。

3.2. 电化学阻抗谱

电化学阻抗谱（EIS）分析进一步揭示了电极修饰界面的变化。对于仅修饰链霉亲和素的电极（SPCE-str.），其奈奎斯特图呈现单一半圆。而固定适配体后，图谱出现两个明显的半圆，表明存在两个电荷转移过程。数据拟合显示，适配体固定后，第一电荷转移电阻（R_ct1）增加，这归因于适配体层对氧化还原探针扩散的阻碍。随后与SARS-CoV-2刺突蛋白结合，R_ct1进一步增大，符合蛋白质大分子造成额外表面阻塞的预期。在所有测试中，Aptamer 3再次表现出最显著的阻抗变化，证实其与靶蛋白结合的有效性。

3.3. 链霉亲和素SPCE修饰后的形貌

原子力显微镜（AFM）图像直观展示了电极表面的逐步修饰。链霉亲和素修饰的SPCE表面相对不平整，最大高度为133.20 nm。固定Aptamer 3后，表面粗糙度显著增加，最大高度升至209.50 nm。当与SARS-CoV-2刺突蛋白结合后，最大高度进一步增至388.40 nm，而计算表面积减小至1.19 μm²。这些形貌变化为生物分子的成功固定和结合提供了直接证据。

3.4. 扫描速率的影响

通过研究不同扫描速率下的CV行为，发现所有修饰电极的峰值电流随扫描速率增加而增加，且氧化还原峰分离大于50 mV，表明电化学体系为准可逆过程。log I 对 log ν 作图的斜率在0.42至0.52之间，说明反应受扩散控制。计算得到的异相电子转移速率常数（k⁰）在7.4 × 10^–2到 10.0 × 10^–2cm s^–1之间，也支持准可逆反应的结论。

3.5. 电分析特性

差分脉冲伏安法（DPV）用于评估传感器对不同浓度SARS-CoV-2刺突蛋白的响应。如图7所示，随着刺突蛋白浓度（0.05 至 5 μM）增加，峰值电流降低，这是由于蛋白质结合在电极表面形成了绝缘层。校准曲线在测试范围内呈现良好的线性关系（R²= 0.95）。基于此，计算出传感器的灵敏度为8.03 μA μM^–1，检测限（Limit of Detection, LOD）为0.48 μM。与文献中其他采用更复杂修饰（如金纳米颗粒、碳纳米管）的传感器相比，本传感器虽然检测限并非最低，但其制备方法简单、快速、成本低，且具有良好的重现性。

3.6. 稳定性和重现性研究

稳定性测试显示，在5°C储存两周后，传感器的DPV电流响应下降了9.20%，表明其活性有一定损失，建议现配现用。重现性研究则表明，在0.05至5 μM的浓度范围内，对三个独立电极进行测试，其相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）均不超过10%，证明了传感器优异的重复制备和测量可靠性。

3.7. 干扰研究

选择性测试评估了传感器在可能存在的干扰物（如牛血清白蛋白、尿酸、葡萄糖、组氨酸）中的表现。结果显示，牛血清白蛋白的交叉反应性较低（响应比靶蛋白低25.82%），但尿酸和葡萄糖产生的信号与靶蛋白相当甚至更高，表明当前传感器在复杂生物基质中的选择性有待提高，需要进一步的表面工程优化（如引入抗污层或筛选新适配体）来减少非特异性吸附。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于链霉亲和素修饰丝网印刷碳电极（SPCE-str.）和特异性适配体（Aptamer 3）的新型无标记电化学适配体传感器，用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白。该传感器具有制备简单、快速、成本低廉的优点。电化学和形貌表征均证实了适配体及靶蛋白在电极表面的成功固定与结合。传感器表现出0.05至5 μM的线性检测范围、8.03 μA μM^–1的灵敏度、0.48 μM的检测限以及出色的重现性（RSD ≤ 10%），其性能与许多已报道的传感器具有可比性。

然而，研究也明确指出当前传感器在选择性上面临挑战，常见的生物分子如葡萄糖和尿酸会对其产生显著干扰。这揭示了在追求简化、低成本设计时，在复杂样品基质中实现高选择性所固有的权衡。因此，该工作主要作为一个稳健的概念验证平台，为后续的优化和研究奠定了基础。其重要意义在于，它展示了一种不依赖贵金属纳米颗粒等昂贵材料的简易电化学传感架构的可行性，为未来开发适用于现场快速筛查（Point-of-Care Testing, POCT）的传染病诊断工具提供了有价值的思路和技术路径。未来的工作将需要专注于通过改进表面化学、引入抗污层或开发具有更高特异性的新型适配体来提升传感器的选择性和检测限，以推动其在实际临床和环境样本分析中的应用。